結(jié)腸癌中骨橋蛋白與環(huán)氧化酶-2的表達及臨床意義

趙嶺嶺 李景光 劉艷彩 吳春平 劉學剛 商慶花

近年來，消化道腫瘤疾病的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，且結(jié)直腸癌發(fā)病率在各類消化道腫瘤疾病中占第二位，因早期缺乏典型癥狀、體征，多數(shù)患者確診時處中晚期階段，給臨床治療造成較大困擾，且影響患者預后［1］。目前臨床主要以手術切除治療為主，但需盡早發(fā)現(xiàn)和診斷，以及盡早采取手術切除治療。結(jié)腸癌死亡的主要原因是因癌細胞復發(fā)或肝臟轉(zhuǎn)移，所以早期診斷并了解結(jié)腸癌是否轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移范圍等對指導臨床治療和改善患者預后具有重要價值［2］。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)［3-4］，長期大量使用阿司匹林等非甾體類抗炎藥物者，其發(fā)生結(jié)腸癌率可降低40%～50%，但其具體作用機制尚不完全清楚，因此導致該藥物推廣及應用受限。以往有研究發(fā)現(xiàn)［5-6］，非甾體類抗炎藥物可通過抑制環(huán)氧化酶（COX）途徑來抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)［7］，COX-2與人類多種腫瘤疾病存在緊密聯(lián)系，且參與調(diào)控腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展機制，同時其還可抑制腫瘤細胞凋亡和抑制宿主的免疫應答，有效逃避對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視，加速腫瘤血管生成、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等。骨橋蛋白（OPN）與人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在緊密聯(lián)系，其可促進腫瘤細胞趨化和粘附，同時還可抑制腫瘤細胞凋亡，加速細胞外基質(zhì)降解和促進腫瘤血管生成，此外，OPN過度表達與人類肝癌和胃癌等轉(zhuǎn)移、惡性程度等均有關［8］。由此可見，研究OPN、COX-2的表達狀況具有重要意義。本次研究為回顧性分析，選取于河北省衡水市第四人民醫(yī)院行手術治療的100例患者手術組織標本，并選取100例患者癌旁正常組織作為對照，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取衡水市第四人民醫(yī)院病理科2016年1月～2018年2月期間存檔的100例結(jié)腸癌手術標本作為研究組，另按照1:1選取同一手術患者100例癌旁正常組織作為研究對照組，距離癌組織＞5 cm，且病理證實為正常組織。研究組：男性70例、女性30例；年齡42～86歲，平均為（61.77±4.18）歲；腫瘤直徑＜5 cm者48例、≥5 cm者52例；浸潤漿膜者69例、浸潤漿膜及肌層者31例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期22例、Ⅲ～Ⅳ期78例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移者54例、無轉(zhuǎn)移者46例；中高分化者40例、低分化者60例。因按照1:1比例選取的標本，所以性別和年齡比較無明顯差異（P＞0.05），具有可比性。

二、實驗方法

常規(guī)取材后采用10%福爾馬林溶液進行固定，然后常規(guī)石蠟包埋后切片（4 μm）。

主要試劑：（1）免疫人COX-2單克隆抗體、（2）鼠抗人OPN單克隆抗體、（3）生物素標記二抗工作液、（4）封閉用正常山羊血清工作液、兔血清封閉液、（5）DAB顯色液等。均由北京中山生物技術公司提供。

儀器設備：石蠟切片機、冰箱、攪拌器、恒溫水浴箱、電烤箱、顯微鏡等。

免疫組化法：本次研究采用已知陽性者作為陽性對照，采用PBS為陰性對照。

步驟：先切片為4 μm厚度，然后放置于載玻片上，放置于烤箱中烤180 min（60 ℃），脫蠟至水；采用3%過氧化氫進行孵育，時間5 min；采用蒸餾水沖洗，并于PBS溶液中浸泡5 min，之后放置于PH值為6.0的枸櫞酸溶液中，采用750 W微波加熱，時間10 min；采用10%山羊血清封閉，時間10 min；將血清倒去，然后再次加入（COX-2/OPN），于4 ℃環(huán)境下過夜；采用PBS溶液洗3 min（3次），然后加入生物素標記的二抗；于37℃環(huán)境中孵育，時間30 min；再次PBS溶液洗3 min（3次），并加入過氧化酶標記的鏈霉卵白素，于37℃環(huán)境中孵育，時間30 min；PBS溶液洗3 min（3次），采用DAB進行顯色，于顯微鏡下觀察；最后采用蘇木素進行復染，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

三、觀察指標

分析兩者表達水平與臨床病理特征間的相關性。結(jié)果判定：由本院3名病理科經(jīng)驗豐富的醫(yī)生負責閱片，按照染色強度與陽性細胞比例判斷，陽性細胞≥10%則判斷為陽性，否則為陰性，見圖 1～6。

四、統(tǒng)計學方法

采用19.0統(tǒng)計學軟件處理，數(shù)據(jù)間比較采用卡方檢驗和Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、OPN、COX-2在結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中的陽性表達情況

研究組中OPN表達陽性率為84.0%，明顯高于對照組17.0%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=89.789，P=0.000）；研究組中COX-2陽性表達率78.0%，明顯高于對照組32.0%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=42.747，P=0.000）。

二、OPN在結(jié)腸癌組織中陽性表達情況

OPN在結(jié)腸癌組織中陽性表達與腫瘤TNM分期和分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，P＜0.05；見表1。

圖1 免疫組化檢測OPN結(jié)腸癌中強陽性表達（SP×200胞漿內(nèi)深棕色顆粒）

圖2 免疫組化檢測OPN結(jié)腸癌中弱陽性表達（SP×200胞漿內(nèi)淺棕色顆粒）

圖3 免疫組化檢測OPN結(jié)腸癌中PBS代替一抗陰性對照表達（SP×200）

圖6 免疫組化檢測COX-2結(jié)腸癌中PBS代替一抗陰性對照表達（SP×200）

圖4 免疫組化檢測COX-2結(jié)腸癌中強陽性表達（SP×200胞漿內(nèi)深棕色顆粒）

圖5 免疫組化檢測COX-2結(jié)腸癌中弱陽性表達（SP×200胞漿內(nèi)淺棕色顆粒）

三、COX-2在結(jié)腸癌組織中陽性表達情況

COX-2陽性表達與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，P＜0.05；見表2。

表1 OPN在結(jié)腸癌組織中陽性表達情況

四、PN陽性表達與COX-2陽性表達相關性

結(jié)腸癌組織中OPN陽性表達與COX-2陽性表達呈正相關性（r=3.821，P=0.000）。見圖7。

討 論

OPN最初由Senger從惡性轉(zhuǎn)化上皮細胞株中所提取到，主要是一種與腫瘤相關的蛋白質(zhì)，其可通過與受體CD44、整合素結(jié)合來加速腫瘤細胞黏附等，抑制腫瘤細胞的凋亡，同時還可加速新生血管生成，抑制人體免疫功能等，最終致腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和浸潤［9］。有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)［10-12］，OPN與腫瘤轉(zhuǎn)移存在緊密聯(lián)系。OPN還可增強腎上腺癌細胞株的侵襲能力，通過轉(zhuǎn)染整合素avβ3可增強其侵襲力。OPN過度表達與胃癌等惡性腫瘤惡性程度和轉(zhuǎn)移等有關，且OPN陽性表達程度與患者預后存在緊密聯(lián)系［13-14］。本次研究發(fā)現(xiàn)，OPN在結(jié)腸癌組織中的陽性表達率明顯高于正常癌旁組織，P＜0.05，由此可見OPN在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用，且其陽性表達與結(jié)腸癌惡性程度、TNM分期等有關，這與當前各文獻報道結(jié)果相似［15-16］。同時也說明OPN可增強癌細胞的侵襲能力，加速癌細胞轉(zhuǎn)移和浸潤，預示著患者預后。

表2 COX-2在結(jié)腸癌組織中陽性表達情況

圖7 PN陽性表達與COX-2陽性表達相關性

COX是前列腺素合成期間的限速酶，其中COX-2在多數(shù)腫瘤人群中表現(xiàn)為過表達，其過表達與惡性腫瘤浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后不良存在緊密聯(lián)系。結(jié)腸癌中COX-2為高表達，其可通過合成致癌物質(zhì)和加速新生血管生成等來促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展［17-18］。本次研究結(jié)果顯示，COX-2在結(jié)腸癌組織中表現(xiàn)為過表達，且與患者年齡和腫瘤大小等無關，而與結(jié)腸癌分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關，這與當前各文獻報道結(jié)果一致［19-20］。所以檢測COX-2可較好地評價患者病情程度和預后狀況；同時也說明COX-2參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展及腫瘤轉(zhuǎn)移等。本次研究顯示，結(jié)腸癌組織標本中OPN、COX-2表達水平明顯高于正常癌旁組織，并呈正相關性，說明檢測OPN、COX-2表達可有助于臨床醫(yī)師更好的了解結(jié)腸癌患者病情嚴重程度和腫瘤細胞浸潤程度、轉(zhuǎn)移等，且檢測兩者可指導臨床治療和預后判斷，但兩者具體作用機制還有待深入研究［21］。

綜上所述，通過檢測結(jié)腸癌患者OPN、COX-2表達水平，可有助于醫(yī)師判斷患者預后和病情嚴重程度，從而開展針對性治療方案。