金耳深層發(fā)酵培養(yǎng)基篩選和條件優(yōu)化研究

康林芝 林小喬 金 磊 門戈陽 劉永吉

（1韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005；2廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州510640）

金耳（Tremella aurantialba）為真菌植物門真菌，又稱黃木耳。作為一種珍稀的優(yōu)質(zhì)食藥用真菌，金耳除了含有珍貴的金耳多糖之外，還含有豐富的人體必需氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，其具有滋陰養(yǎng)肺、止咳化痰、降血糖、抗氧化等多種藥理活性，是一種理想的食品、保健品及高級(jí)化妝品原料，商業(yè)價(jià)值極高[3-7]。目前關(guān)于金耳固體栽培配方研究較多，結(jié)果顯示藥渣、棉籽殼作為原料培養(yǎng)金耳的效果較好，但仍存在生物轉(zhuǎn)化率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)及成本高等問題[8-10]，因此金耳相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與研究工作在很大方面受到了限制。

與人工栽培金耳比較，利用發(fā)酵方法獲得菌絲體具備更大的優(yōu)勢(shì)，例如發(fā)酵周期很短、控制培養(yǎng)條件容易、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、不受季節(jié)限制等顯著優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)也有關(guān)于金耳深層發(fā)酵的報(bào)道，如汪虹等報(bào)道采用玉米粉2%，蔗糖3%，酵母膏0.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%的培養(yǎng)基，接種量為80 mL的條件培養(yǎng)有利于金耳菌絲的生長(zhǎng)，已發(fā)表的關(guān)于金耳發(fā)酵條件優(yōu)化研究論文中試劑均為分析純，不可直接用于食品開發(fā)[11-12]。而且不同菌種的碳氮源利用率及條件都會(huì)有所不同，筆者采用全食品級(jí)原料，以菌絲體干重為指標(biāo)，對(duì)金耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化[13-15]，獲得金耳液體發(fā)酵最佳的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，為后續(xù)金耳菌絲體及發(fā)酵液產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金耳菌種：金耳菌種購買于昆明食用菌研究所。

PDA斜面培養(yǎng)基：新鮮土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL。

液體種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中不加瓊脂，分裝于250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：每100 mL含葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，VB10.02 g。

培養(yǎng)基中所用原料均為食品級(jí)，購買于韶關(guān)市新創(chuàng)意實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化

金耳菌種活化采用無菌操作方式將母種菌塊接種到斜面上，置于25℃培養(yǎng)，至菌絲延伸至整個(gè)斜面取出，4℃下保存待用。

種子液的制備：將斜面菌種分割成黃豆大的小塊，接種到液體種子培養(yǎng)基中，每瓶接5～8塊斜面菌塊，搖床振蕩培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 不同碳源對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的影響

在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加0.5 g/100 mL蛋白胨作為氮源，利用不同的碳源研究適宜金耳生長(zhǎng)的最佳碳源，碳源分別為3 g/100 mL麩皮、3 g/100 mL玉米粉、3 g/100 mL紅薯粉。三種不同碳源的液體培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶，每瓶100 mL，分別接種金耳液體菌種后于160 r/min搖床中26℃培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵完成后，將過濾后的菌絲體放入培養(yǎng)皿中，置于干燥箱中60℃烘干至恒重，測(cè)定菌絲體干重將其作為評(píng)價(jià)金耳生物量指標(biāo)，結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)方法，利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選較佳的碳源。

1.2.2.2 最佳碳源添加量對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的影響

由1.2.2.1得出金耳液體培養(yǎng)的最佳碳源，在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中將最佳碳源添加量設(shè)為1 g/100 mL、2 g/100 mL、3 g/100 mL、4 g/100 mL、5 g/100 mL并添加0.5 g/100 mL蛋白胨作為氮源。接種、培養(yǎng)方法等同1.2.2.1。

1.2.2.3 不同氮源對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的影響

在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加3 g/100 mL紅薯粉作碳源，氮源分別為0.5 g/100 mL蛋白胨、0.5 g/100 mL酵母膏和0.5 g/100 mL大豆粉。接種、培養(yǎng)方法等同1.2.2.1。篩選較佳氮源。

1.2.2.4 最佳氮源添加量對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的影響

由1.2.2.3得出金耳液體培養(yǎng)的最佳氮源，在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加3 g/100 mL紅薯粉作碳源，最佳氮源添加量設(shè)為0.2 g/100 mL、0.4 g/100 mL、0.6 g/100 mL、0.8 g/100 mL、1.0 g/100 mL。接種、培養(yǎng)方法等同1.2.2.1。

1.2.2.5 pH對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加3 g/100 mL紅薯粉和0.6 g/100 mL蛋白胨，培養(yǎng)基起始pH分別調(diào)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，接種、培養(yǎng)方法等同1.2.2.1。確定培養(yǎng)基適宜pH。

1.2.2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加3 g/100 mL紅薯粉和0.6 g/100 mL蛋白胨，調(diào)pH為5.0，利用不同溫度來研究適宜金耳生長(zhǎng)的最適溫度，培養(yǎng)溫度分別調(diào)為22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃，接種、培養(yǎng)方法等同1.2.2.1。確定適宜培養(yǎng)溫度。

1.2.2.7 接種量對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加3 g/100 mL紅薯粉和0.6 g/100 mL蛋白胨，培養(yǎng)基pH為5.0，接種量分別為1 mL/100 mL、3 mL/100 mL、5 mL/100 mL、7 mL/100 mL、9 mL/100 mL、11 mL/100 mL、13 mL/100 mL。接種、培養(yǎng)方法等同1.2.2.1。確定適宜液體菌種接種量。

1.2.3 正交試驗(yàn)

以最優(yōu)接種量、pH和培養(yǎng)溫度為正交試驗(yàn)因素，結(jié)合其他單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定每個(gè)因素水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)并予以驗(yàn)證，最后得出最優(yōu)的金耳液體培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源試驗(yàn)結(jié)果

在供試碳源中，碳源為紅薯粉時(shí)金耳菌絲體生物量最大，菌絲干重達(dá)到0.76 g/100 mL，其次為以玉米粉為碳源時(shí)，菌絲體干重為0.65 g/100 mL，碳源為麩皮時(shí)菌絲干重最低，為0.54 g/100 mL。因此選擇紅薯粉為后續(xù)試驗(yàn)培養(yǎng)基有機(jī)碳源。

2.1.2 最佳碳源添加量試驗(yàn)結(jié)果

由圖1中可看出，紅薯粉的添加量對(duì)金耳菌絲體生物量影響顯著。當(dāng)紅薯粉添加量為4 g/100 mL時(shí)，金耳菌絲生物量最大。因此以4 g/100 mL為后續(xù)試驗(yàn)紅薯粉添加量。

圖1 不同濃度紅薯粉對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響

2.1.3 氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果

以蛋白胨、酵母粉、大豆粉作液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)量分別為0.72 g/100 mL、0.59 g/100 mL和0.31 g/100 mL。由此可知，金耳菌絲對(duì)蛋白胨利用效果最好，選用蛋白胨作為后續(xù)試驗(yàn)金耳液體培養(yǎng)的主要氮源。

2.1.4 最佳氮源添加量試驗(yàn)結(jié)果

圖2 不同濃度蛋白胨對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響

由圖2可看出，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.6 g/100 mL時(shí)，金耳菌絲生物量最大，大于此添加量后，菌絲生物量又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因可能是高濃度蛋白胨抑制了金耳菌絲生長(zhǎng)。以0.6 g/100 mL蛋白胨添加量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5 培養(yǎng)基起始pH試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，金耳菌絲生長(zhǎng)pH范圍較廣，pH3～6都能生長(zhǎng)，但最適菌絲生長(zhǎng)pH為5，菌絲生物量達(dá)到最大值。

圖3 不同pH對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響

2.1.6 液體培養(yǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，溫度對(duì)金耳菌絲的生物量影響較大，雖然金耳菌絲在22～30℃均可生長(zhǎng)，但最適生長(zhǎng)溫度為24～27℃。

圖4 不同溫度對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響

2.1.7 接種量試驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，金耳菌絲生物量隨著接種量的增加而逐漸提高，但考慮到經(jīng)濟(jì)性，接種量以7 mL/100 mL較為理想。

圖5 接種量對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量（A）、pH（B）和培養(yǎng)溫度（C）進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)（表1），最終確定最優(yōu)的金耳發(fā)酵培養(yǎng)條件，結(jié)果見表2。

由表2可見，3個(gè)因素中對(duì)金耳菌絲生物量影響程度大小為C＞A＞B，即溫度＞接種量＞pH。三因素較佳組合A3B2C1，金耳菌絲生物量最高。

驗(yàn)證試驗(yàn)（三重復(fù)）結(jié)果金耳菌絲體干重1.25 g/100 mL，與正交試驗(yàn)結(jié)果較為一致。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

通過對(duì)金耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源以及發(fā)酵條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，獲得了食品級(jí)原料發(fā)酵培養(yǎng)基，具體配方為葡萄糖2 g/100 mL，紅薯粉4 g/100 mL，蛋白胨0.6 g/100 mL，磷酸二氫鉀0.3 g/100 mL，硫酸鎂0.15 g/100 mL，VB12 mg/100 mL。最佳培養(yǎng)條件為在培養(yǎng)溫度24℃，培養(yǎng)基pH5.5，接種量為7 mL/100 mL。此培養(yǎng)條件下金耳菌絲生長(zhǎng)旺盛、生物量較高，可為后續(xù)金耳發(fā)酵液產(chǎn)品規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。