信號(hào)分子調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成的分子機(jī)制

涂春田，汪洋，易力，王瑜欣，劉寶寶，宮勝龍

?

信號(hào)分子調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成的分子機(jī)制

涂春田1，汪洋1，易力2，王瑜欣1，劉寶寶1，宮勝龍1

1 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng)市畜禽分子病原與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003 2 洛陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471022

涂春田, 汪洋, 易力, 等. 信號(hào)分子調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成的分子機(jī)制.生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 558–566.Tu CT, Wang Y, Yi L, et al. Roles of signaling molecules in biofilm formation. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 558–566.

細(xì)菌生物被膜 (Bacterial biofilm，BF) 是黏附于機(jī)體黏膜或生物材料表面、由細(xì)菌及其分泌的多聚糖、蛋白質(zhì)和核酸等組成的被膜狀生物群體，是造成持續(xù)性感染的重要原因之一。細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，部分會(huì)作為生物信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間傳遞信息，使細(xì)菌在多細(xì)胞水平協(xié)調(diào)統(tǒng)一相互配合，以完成一些重要的生理學(xué)功能，如生物發(fā)光、BF的形成、運(yùn)動(dòng)與固定態(tài)生活方式的轉(zhuǎn)換等。信號(hào)分子在BF形成過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。文中從密度感應(yīng)系統(tǒng) (Quorum-sensing systems，QS)、環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)、雙組分系統(tǒng) (Two-component systems，TCS) 和sRNA等方面介紹影響B(tài)F形成的相關(guān)信號(hào)分子，重點(diǎn)對(duì)BF形成過(guò)程中的信號(hào)分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行概述，這對(duì)于深入揭示信號(hào)分子調(diào)控BF形成的機(jī)制十分必要。

生物被膜，信號(hào)分子，密度感應(yīng)系統(tǒng)，sRNA，c-di-GMP

生物被膜 (Bacterial biofilm，BF) 是指黏附于機(jī)體黏膜或生物材料表面、由細(xì)菌分泌的胞外聚合物 (EPS) 組成的基質(zhì)包裹菌體形成的被膜狀生物群體[1]。EPS主要是由細(xì)菌自發(fā)產(chǎn)生，由多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞外DNA (eDNA) 和生物表面活性劑組成。據(jù)報(bào)道，自然界中任何成熟的細(xì)菌均可形成BF，成熟BF可以是同種或不同種細(xì)菌共同形成的。細(xì)菌BF狀態(tài)被認(rèn)為是一種細(xì)菌適應(yīng)不良環(huán)境而形成的保護(hù)模式。已經(jīng)證明，與浮游細(xì)胞相比，生活在BF內(nèi)的細(xì)菌抵抗抗生素和免疫系統(tǒng)的能力更強(qiáng)[2-3]，這加強(qiáng)了人們對(duì)這種細(xì)菌生命形式的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，BF能增強(qiáng)細(xì)菌的耐受性有諸多原因，主要包括細(xì)菌在BF內(nèi)緩慢生長(zhǎng)和由各種生物聚合物組成的細(xì)胞外基質(zhì)的存在。BF與其周圍基質(zhì)的形成和被膜內(nèi)細(xì)菌增殖受到許多因素的影響，包括參與BF生命周期的不同階段的多個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

信號(hào)分子是細(xì)菌在代謝過(guò)程中自主產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，它不僅能在胞內(nèi)調(diào)控細(xì)菌個(gè)體的生命活動(dòng)，還能分泌到胞外調(diào)節(jié)細(xì)胞間的生命活動(dòng)，BF的形成已被證實(shí)受多種信號(hào)分子的調(diào)控[4]。近年來(lái)，有關(guān)細(xì)菌BF的形成過(guò)程和結(jié)構(gòu)成分的研究已有報(bào)道，但就信號(hào)分子與細(xì)菌BF形成的關(guān)系卻報(bào)道較少，而揭示二者之間的關(guān)系會(huì)為解決病原菌的持續(xù)性感染提供一個(gè)全新的思路。本文概述了4個(gè)調(diào)控系統(tǒng)QS、c-di-GMP、雙組分系統(tǒng)和sRNA，重點(diǎn)闡述了相關(guān)信號(hào)分子與BF形成的關(guān)系 (圖1表示QS、c-di-GMP、雙組分系統(tǒng)和sRNA對(duì)BF的調(diào)控機(jī)制)，以期尋找出合適的能抑制BF相關(guān)信號(hào)分子傳遞的抑制劑。

1 密度感應(yīng)系統(tǒng) (QS) 相關(guān)信號(hào)分子

20世紀(jì)70年代，Hasting等[6]通過(guò)對(duì)海洋魚(yú)類共生細(xì)菌費(fèi)氏弧菌和哈維氏弧菌的發(fā)光機(jī)制的研究，揭示了細(xì)菌與細(xì)菌間是存在信息交流的。這種細(xì)菌通過(guò)自身產(chǎn)生的信號(hào)分子進(jìn)行交流和協(xié)調(diào)群體行為的過(guò)程稱為密度感應(yīng)。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種介導(dǎo)密度感應(yīng)有關(guān)的信號(hào)分子，如N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-Acyl homoserine lactones，AHL)、自誘導(dǎo)多肽(Autoinducing peptide，AIP)、自誘導(dǎo)分子Ⅱ (Autoinducer-2，AI-2) 和擴(kuò)散性信號(hào)分子(Diffusible signal factor，DSF) 等，本文以AIP、AHL和AI-2這3種研究比較廣泛的QS信號(hào)分子為例，闡述其調(diào)控BF形成的相關(guān)機(jī)制。

1.1 自誘導(dǎo)多肽(Autoinducing peptide，AIP)

AIP是革蘭陽(yáng)性菌中的寡肽類自誘導(dǎo)信號(hào)分子，是參與細(xì)菌種內(nèi)信息交流的QS信息分子。目前對(duì)于革蘭陽(yáng)性菌AIP信號(hào)分子的研究較多的是葡萄球菌，其調(diào)控基因是附屬基因調(diào)節(jié)子 (Accessory gene regulator，agr)，能產(chǎn)生和感應(yīng)的信號(hào)分子為自誘導(dǎo)物 (AIP)。agr是由RNA Ⅱ和RNA Ⅲ兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元組成，其啟動(dòng)子分別是P2和P3，RNA Ⅱ的轉(zhuǎn)錄框包括、、和4個(gè)基因的agr操縱子，RNA Ⅲ的轉(zhuǎn)錄框是agr系統(tǒng)的效應(yīng)分子，編碼α-溶血素和δ-毒素等毒力因子。和產(chǎn)物參與AIP的產(chǎn)生；和基因編碼的蛋白質(zhì)形成一個(gè)雙組分系統(tǒng) (Two component system，TCS)，AgrC是雙組分系統(tǒng)的感應(yīng)激酶，能結(jié)合AIP，并磷酸化激活A(yù)grA，激活的AgrA與P2和P3結(jié)合從而誘導(dǎo)RNA Ⅱ和RNA Ⅲ的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，活化的agr可進(jìn)一步增強(qiáng)AIP 的表達(dá)，對(duì)agr的自激活機(jī)制起到信號(hào)放大的作用。

大量研究表明，agr介導(dǎo)的群體密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)葡萄球菌BF的形成有著極其重要的影響，具有上調(diào)細(xì)胞與BF分離、下調(diào)BF初始黏附的作用。agr可上調(diào)酚溶解性調(diào)理素(Phenol-soluble modulins，PSMs) 和蛋白酶的表達(dá)，從而促進(jìn)后期細(xì)胞與BF的分離[7]。研究浮游態(tài)金黃色葡萄球菌和BF狀態(tài)下金黃色葡萄球菌agr活性發(fā)現(xiàn)，浮游態(tài)的細(xì)菌表現(xiàn)出高水平的agr活性，而B(niǎo)F中的細(xì)胞主要抑制agr系統(tǒng)，這表明agr系統(tǒng)參與了BF的脫落[8]。agr還可以通過(guò)下調(diào)如自溶血素E (Autolysin E，AtIE) 等與BF初期形成有關(guān)的粘附分子的形成從而調(diào)控BF，Dai等[9]通過(guò)對(duì)野生表皮葡萄球菌與agr突變株形成BF能力對(duì)比發(fā)現(xiàn)，agr突變株形成更厚的BF，而agr和AtIE雙突變菌株BF形成功能嚴(yán)重受損，在agr突變株中，AtlE 表達(dá)量增加，而在agr與AtlE雙突變株中幾乎沒(méi)有AtlE表達(dá)。由此表明，agr突變株通過(guò)增加AtIE 的產(chǎn)生量，從而加強(qiáng)細(xì)菌的初始黏附功能，使BF形成能力增強(qiáng)。

1.2 N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones，AHL)

由信號(hào)分子AHL介導(dǎo)的QS系統(tǒng)，是革蘭陰性菌種內(nèi)通訊語(yǔ)言，它在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)多種生理功能，如毒力因子的產(chǎn)生和BF的形成。革蘭陰性菌中的QS系統(tǒng)被稱為L(zhǎng)uxI/LuxR型自誘導(dǎo)系統(tǒng)，其信號(hào)分子是AHL。在LuxI/LuxR調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，LuxI型蛋白是負(fù)責(zé)產(chǎn)生AHL分子的酶，而LuxR型蛋白是負(fù)責(zé)接收AHL分子的受體。

AHL分子的碳鏈長(zhǎng)度不同，短鏈分子 (4–8個(gè)碳原子) 可以通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞，長(zhǎng)鏈分子 (10–12個(gè)碳原子) 需要主動(dòng)運(yùn)輸通過(guò)細(xì)胞膜。AHL通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散到細(xì)菌周圍并富集到特定密度后，AHL分子會(huì)重新進(jìn)入細(xì)胞結(jié)合到LuxR受體蛋白上，激活LuxR蛋白并形成R-AHL復(fù)合體，隨后R-AHL復(fù)合體與目的激活子相互作用誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，如合成胞外多糖、毒力因子及藻酸鹽等。銅綠假單胞菌野生株形成的BF高度結(jié)構(gòu)化、較厚，但臨床分離獲得的不產(chǎn)生AHL信號(hào)分子的突變株則不能形成成熟的BF[10]。研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌PA01 突變株 (不能產(chǎn)生AHL) 形成的BF扁平、均質(zhì)，人工添加AHL信號(hào)分子后，又能形成與野生型菌株相同的有結(jié)構(gòu)的、異質(zhì)化的BF[11]，這證實(shí)了AHL在銅綠假單胞菌BF的形成過(guò)程中具有重要作用。大多數(shù)革蘭陰性菌如熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌等都使用LuxI/LuxR型自誘導(dǎo)系統(tǒng)，沙門菌屬、埃希菌屬和克雷伯桿菌屬在革蘭陰性菌中是例外，因?yàn)樗鼈兊腖uxI/LuxR型自體誘導(dǎo)系統(tǒng)不完善[12-13]，這些屬的細(xì)菌不具有LuxI家族或其他AHL合酶，然而，它們有LuxR家族蛋白質(zhì)，可以感知某些AHL分子，從而被調(diào)控。

1.3 自誘導(dǎo)物Ⅱ (AI-2)

由LuxS/AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌中，其信號(hào)分子AI-2被認(rèn)為是種間通用信號(hào)分子[14]。AI-2的合成需要基因編碼的LuxS蛋白酶的催化作用，細(xì)菌產(chǎn)生的AI-2分泌到細(xì)胞外環(huán)境，隨著細(xì)胞的分裂增殖，胞外的AI-2的濃度也會(huì)不斷增加，當(dāng)AI-2濃度達(dá)到閾值后細(xì)菌通過(guò)感應(yīng)周圍AI-2信號(hào)分子的濃度而對(duì)其周圍細(xì)菌進(jìn)行“計(jì)數(shù)”，并會(huì)通過(guò)一系列的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控與QS相關(guān)的基因的表達(dá)，如BF的形成和毒力因子等基因的表達(dá)[14]。

本課題組一直致力于豬鏈球菌 (，SS) LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)的研究，利用同源重組原理構(gòu)建了豬鏈球菌2型基因缺失株、互補(bǔ)株和過(guò)表達(dá)株，研究發(fā)現(xiàn)缺失株不能產(chǎn)生AI-2信號(hào)分子[15]，而過(guò)表達(dá)菌株AI-2信號(hào)分子產(chǎn)生量也并未增加，缺失基因?qū)S的BF的形成產(chǎn)生了顯著的影響，過(guò)表達(dá)菌株形成生物被膜的能力有一定增強(qiáng)，并隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加[16]。外源添加0–2 μmol/L的AI-2分子能夠顯著增加SS生物被膜的形成，而添加2–15 μmol/L的AI-2分子后生物被膜的形成能力受到抑制，外源添加AI-2分子能顯著提高缺失株的生物被膜形成能力[17]。研究發(fā)現(xiàn)SS隨細(xì)菌密度的增加胞外AI-2信號(hào)分子的濃度也在不斷增加，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期達(dá)到最大，穩(wěn)定期和衰亡期迅速減少，這說(shuō)明SS能將胞外AI-2運(yùn)至胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)存在AI-2的攝取機(jī)制和與之結(jié)合的受體蛋白。添加不同濃度AI-2分子可以顯著提高毒力基因、和的表達(dá)，而、和基因表達(dá)卻有一定下調(diào)[17]。AI-2信號(hào)分子可能通過(guò)與受體蛋白結(jié)合來(lái)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而影響B(tài)F的形成。課題組解析了豬鏈球菌LuxS蛋白晶體的三維晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)位于底物結(jié)位點(diǎn)附近80位和87位氨基酸發(fā)生了可能的進(jìn)化突變，通過(guò)定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)2個(gè)氨基酸的突變對(duì)其底物結(jié)合和酶的催化能力有較大影響，并影響豬鏈球菌AI-2的產(chǎn)生和BF的形成能力[18]。

2 環(huán)二鳥(niǎo)苷酸 (c-di-GMP)

小分子核苷酸c-di-GMP是細(xì)菌中普遍存在的第二信使，它在BF的形成和運(yùn)動(dòng)的切換之中作為胞內(nèi)的信號(hào)分子而起著重要作用，近年來(lái)在生物界引起了廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，它是通過(guò)改變病原體的生活方式，從而提高病原體的生存潛力。病原菌生活方式的轉(zhuǎn)換受c-di-GMP在細(xì)胞內(nèi)的濃度調(diào)控，低水平的c-di-GMP能促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)基因的表達(dá)，高水平c-di-GMP表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞粘附因子的產(chǎn)生和胞外基質(zhì)組分的增加，使細(xì)菌更易粘附在細(xì)胞或生物材料表面，有利于BF的形成[19]。c-di-GMP在細(xì)胞內(nèi)的濃度受兩種酶的調(diào)節(jié)：鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶 (DGCs)，含GGDEF結(jié)構(gòu)域由兩分子GTP合成c-di-GMP；磷酸二酯酶 (PDEs)，含一個(gè)EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域，可降解c-d-GMP，具有EAL結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶將c-di-GMP降解為線性的二核苷酸pGpG，HD-GYP結(jié)構(gòu)域催化c-di-GMP降解為兩分子的GMP分子。此外，還鑒定出了多種同時(shí)含有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能同時(shí)調(diào)控c-di-GMP的合成和降解[20]。c-di-GMP調(diào)控BF形成中的重要作用是通過(guò)調(diào)控一些生物因子例如Psl、Pel、藻酸鹽胞外多糖、表面粘附素CdrA和Ⅳ型菌毛的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。許多研究表明，c-di-GMP在細(xì)胞內(nèi)濃度的變化往往伴隨著B(niǎo)F形成的變化[21]。

銅綠假單胞菌是研究BF的模型生物。研究表明，c-di-GMP能促進(jìn)銅綠假單胞菌中的多種粘附素的產(chǎn)生。如Ⅳ型菌毛的合成依賴于具有c-di-GMP結(jié)合域的蛋白質(zhì)PilZ和FimX的調(diào)控，此外，杯狀菌毛的合成也受到c-di-GMP的調(diào)節(jié)[22]。CupA的表達(dá)依賴于具有GGDEF或c-di-GMP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)WspR、MorA和PA1120[23]。PDE RocR被證明參與了CupB和CupC菌毛的合成，PDE PvrR參與了CupD菌毛的合成[24-25]。此外，CupA已被證明參與SDS誘導(dǎo)的自動(dòng)聚集，這取決于由SiaD DGC介導(dǎo)的c-di-GMP在細(xì)胞內(nèi)增長(zhǎng)的水平。此外，表面蛋白CdrA已被證明能使綠膿桿菌細(xì)胞結(jié)合在Psl多糖上，c-di-GMP在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控表面蛋白CdrA的產(chǎn)生。

研究發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP還能促進(jìn)多糖基因的轉(zhuǎn)錄[26]。當(dāng)RsmA不被sRNA RsmY和RsmZ屏蔽時(shí)，發(fā)現(xiàn)的表達(dá)通過(guò)RsmA蛋白與mRNA的結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)節(jié)。Irie等報(bào)道Psl多糖能通過(guò)SiaD和SadC DGCs刺激c-di-GMP的合成[27]，c-di-GMP濃度的升高會(huì)促進(jìn)Psl多糖的合成和BF基質(zhì)中其他組分產(chǎn)量的增加。胞外多糖可以通過(guò)特異性的正反饋調(diào)節(jié)通路促進(jìn)BF的形成，這可能對(duì)浮游細(xì)菌吸附在現(xiàn)有的BF上起到一定的作用。藻酸鹽是粘液型銅綠假單胞菌分泌的細(xì)胞外多糖和主要粘附因子，是組成BF的重要成分，c-di-GMP能夠與作為藻酸鹽合酶一部分的膜錨定蛋白Alg44的結(jié)構(gòu)域PilZ相結(jié)合，從而正調(diào)控藻酸鹽的產(chǎn)生。Pel多糖的合成在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平都受到c-di-GMP的調(diào)節(jié)，對(duì)銅綠假單胞菌野生型菌株及突變體 (具有升高c-di-GMP水平的能力) 進(jìn)行的微陣列分析表明在突變體中基因的轉(zhuǎn)錄水平增加。此外，還發(fā)現(xiàn)c-di-GMP與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物FleQ結(jié)合，從而誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄[28]。Pel多糖合成在翻譯后水平通過(guò)c-di-GMP與PelD蛋白的結(jié)合而被激活[29]。

大量研究表明，c-di-GMP參與將急性感染轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)性感染[4,30]，與持續(xù)性感染相關(guān)的粘液表型在一定程度上受到c-di-GMP的調(diào)節(jié)，且高濃度的c-di-GMP可將細(xì)菌分泌系統(tǒng)從T3切換到T6，c-di-GMP的這些功能均對(duì)BF的形成具有調(diào)節(jié)作用。

3 雙組分系統(tǒng)(Two component system，TCS) 與sRNA

雙組分系統(tǒng) (TCS) 是QS系統(tǒng)的核心部分，TCS參與調(diào)控細(xì)菌的多種重要生物學(xué)功能，包括與宿主的識(shí)別、細(xì)菌生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)代謝、毒力因子的表達(dá)、致病性及耐藥性等[31]。TCS由兩個(gè)部分組成：位于內(nèi)膜中的組氨酸激酶 (Histidine protein kinases，HPK) 即“受體”和位于細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)蛋白(Regulatory protein，RR) 即“調(diào)控子”。HPK能感受胞外生物信號(hào)和環(huán)境條件的刺激并發(fā)生磷酸化，之后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給其耦聯(lián)的RR保守的天冬氨酸殘基上，磷酸化使RR被激活，激活后的RR可以結(jié)合在受調(diào)控基因的啟動(dòng)子上，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。

在銅綠假單胞菌中，目前已經(jīng)鑒定出60多種雙組分系統(tǒng)，其中Gac系統(tǒng)的研究是最深入的，它最初在丁香假單胞菌中被發(fā)現(xiàn)，由跨膜傳感器激酶GacS (HPK)和其偶聯(lián)調(diào)節(jié)物GacA (RR) 組成，GasS具有一個(gè)自動(dòng)磷酸化的保守組氨酸殘基，被激活后的磷酸基團(tuán)能轉(zhuǎn)移到其偶聯(lián)調(diào)節(jié)物GacA上，影響RsmZ和RsmY兩個(gè)sRNA的轉(zhuǎn)錄[32]。這兩個(gè)sRNA能結(jié)合在CsrA同源物RsmA上，從而影響RsmA蛋白的功能。RsmA是一個(gè)全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，可抑制QS、胞外產(chǎn)物和運(yùn)動(dòng)等不同靶基因的表達(dá)從而影響B(tài)F的形成[33]。最近在銅綠假單胞菌中又鑒定出了一個(gè)CsrA同系物RsmF，RsmF (也稱為RsmN) 是一種與mRNA結(jié)合的蛋白，與RsmA有多個(gè)共同的結(jié)合靶標(biāo)，包括RsmY和RsmZ。然而與RsmA相比，RsmF與這些sRNA的結(jié)合親和力明顯較低。另一方面，RsmF不能結(jié)合pslA顯示出了與RsmA的不同結(jié)合特性[34]。

SagS/BfiS是GacS調(diào)控網(wǎng)路的一個(gè)分支。SagS是細(xì)菌浮游態(tài)和生物被膜態(tài)的一個(gè)開(kāi)關(guān)，并且是可以磷酸化的磷酸激酶。SagS通過(guò)不同調(diào)節(jié)途徑調(diào)控RsmY和RsmZ，其對(duì)RsmY的調(diào)節(jié)依賴于一種組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白HptB[35]，而其對(duì)RsmZ的調(diào)節(jié)是依賴于HptB與另一個(gè)磷酸激酶BfiS的相互作用。BfiS是生物被膜形成過(guò)程中細(xì)胞向不可逆附著過(guò)渡所必需的。BfiS、BfiR的同源RR可激活CafA (RNase G) 的表達(dá)，CafA可以降低RsmZ的表達(dá)水平，而RsmZ的表達(dá)水平的降低是生物被膜成熟和維持所必需的[36]。當(dāng)然，RsmY和RsmZ水平也受到其他調(diào)節(jié)因子的影響，例如Anr/NarL，它能在低氧條件下下調(diào)這兩種sRNA，而β-內(nèi)酰胺酶調(diào)節(jié)劑AmpR，可以上調(diào)RsmZ[37-38]。在細(xì)菌中這些sRNA的轉(zhuǎn)錄水平由多個(gè)交叉調(diào)節(jié)系統(tǒng)緊密調(diào)控，以調(diào)控細(xì)菌從浮游態(tài)生長(zhǎng)模式到生物被膜生長(zhǎng)模式的轉(zhuǎn)變。

除傳感器激酶GacS外，最近又發(fā)現(xiàn)了兩種傳感器激酶RetS (調(diào)節(jié)胞外多糖和Ⅲ型分泌系統(tǒng)) 和LadS (降低細(xì)菌粘附能力) 是通過(guò)GacA調(diào)節(jié)基因表達(dá)進(jìn)而影響B(tài)F的形成。在探索RetS對(duì)GacS/A的影響中，其實(shí)是通過(guò)在RetS和GacS之間形成異二聚體，進(jìn)而導(dǎo)致GacS的自磷酸化被阻斷，表明RetS是GacS的拮抗劑[39]。LadS通過(guò)GacA激活RsmY和RsmZ而具有與RetS相反的功能[40-41]，這表明LadS有助于BF的形成。最近研究報(bào)道了一種新的與RsmA結(jié)合的RsmY/RsmZ型sRNA，被稱為RsmW，研究發(fā)現(xiàn)它不受GacA調(diào)控，與rsmY和rsmZ表達(dá)相反，并發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)BF的形成[42]。

Gac系統(tǒng)除了通過(guò)調(diào)節(jié)QS影響B(tài)F的形成外，通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)它還通過(guò)調(diào)節(jié)胞外多糖Pel、Psl和Ⅳ型菌毛，參與細(xì)菌浮游態(tài)與BF生長(zhǎng)模式之間的轉(zhuǎn)換。Gac系統(tǒng)被認(rèn)為通過(guò)RsmA來(lái)調(diào)節(jié)與type-Ⅲ和type-Ⅳ分泌系統(tǒng)(T3SS和T6SS) 相關(guān)的基因的表達(dá)，在急性和持續(xù)性感染之間起轉(zhuǎn)換作用[26]。體外研究表明，急性感染通常與T3SS產(chǎn)生高毒力因子有關(guān)，而與BF有關(guān)的持續(xù)性感染則表現(xiàn)出較弱的T6SS表達(dá)[43]。通過(guò)對(duì)突變體的研究，得出這一轉(zhuǎn)變是由兩個(gè)傳感器RetS和LadS來(lái)促成的。和的突變體表現(xiàn)出相似的表型，胞外多糖產(chǎn)生增多，BF增多，T3SS的表達(dá)減少，以及Ⅳ型菌毛活力降低[44]。與此相反，突變體表現(xiàn)出T3SS的表達(dá)增強(qiáng)BF形成量降低。近年來(lái)，盡管對(duì)Gac系統(tǒng)進(jìn)行了深入研究，但是由傳感器激酶GacS、LadS和RetS檢測(cè)到的觸發(fā)磷酸化反應(yīng)的信號(hào)仍未鑒定出來(lái)，尋找出傳感器激酶的激活劑是絕大多數(shù)雙組分系統(tǒng)尚未解決的問(wèn)題[45]。然而，尋找傳感器激酶的激活劑有其重要意義，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)它們來(lái)控制傳感器激酶的激活與否，從而調(diào)控細(xì)菌的行為，這對(duì)于細(xì)菌感染的治療是非常有用的。

總之，Gac調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一種復(fù)雜的多激酶網(wǎng)絡(luò)，在調(diào)控細(xì)菌浮游態(tài)生長(zhǎng)模式和生物被膜生長(zhǎng)模式之間起主要作用。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和大量不同的傳感器是整合大量信號(hào)分子并作出最適合細(xì)菌生存指令所必需的。

4 展望

信號(hào)分子可以在細(xì)菌生長(zhǎng)的特定環(huán)境中調(diào)節(jié)其生命活動(dòng)，與BF相關(guān)的信號(hào)分子能使細(xì)菌對(duì)周圍其他細(xì)菌的存在作出反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)整自身的生命活動(dòng)。在過(guò)去十年中，有關(guān)信號(hào)分子調(diào)控致病菌BF形成機(jī)制的研究已取得顯著進(jìn)步，但尋找信號(hào)分子識(shí)別的受體仍然是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的瓶頸。而且生物被膜的形成是由QS、c-di-GMP和雙組分系統(tǒng)等共同調(diào)節(jié)，有意思的是這3個(gè)系統(tǒng)彼此之間存在著一些相同功能，如上文所述高水平c-di-GMP和Gac系統(tǒng)的激活均能誘導(dǎo)生物被膜形成和持續(xù)性感染，這種特性增加了尋找這些信號(hào)分子受體蛋白的難度，也使得生物被膜形成網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜。因此，充分了解參與形成復(fù)雜聚合物的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。但是換言之，與QS、TCS和c-di-GMP相關(guān)的信號(hào)分子均可以作為細(xì)菌生物被膜的研究靶標(biāo)。通過(guò)發(fā)掘QS、c-di-GMP和TCS對(duì)生物被膜形成的機(jī)制，將為尋找新的靶點(diǎn)作用藥物奠定基礎(chǔ)，通過(guò)干擾生物被膜形成的某個(gè)環(huán)節(jié)，將有望產(chǎn)生有效的抗感染治療方法，為徹底治療臨床難治的持續(xù)性感染帶來(lái)新希望。

[1] Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(9): 623–633.

[2] H?iby N, Bjarnsholt T, Givskov M, et al. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicro Agents, 2010, 35(4): 322–332.

[3] Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, 1999, 284(5418): 1318–1322.

[4] Jakobsen TH, Tolker-Nielsen T, Givskov M. Bacterial biofilm control by perturbation of bacterial signaling processes. Int J Mol Sci, 2017, 18(9): 1970.

[5] Solano C, Echeverz M, I?igo L.Biofilm dispersion and quorum sensing. Curr Opin Microbiol, 2014, 18(4):96–104.

[6] Nealson KH, Hastings JW. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance. Microbiol Rev, 1979, 43(4): 496–518.

[7] Loughran AJ, Atwood DN, Anthony AC, et al. Impact of individual extracellular proteases onbiofilm formation in diverse clinical isolates and their isogenic sarA mutants. Microbiologyopen, 2014, 3(6): 897–909.

[8] Yarwood JM, Bartels DJ, Volper EM, et al. Quorum sensing inbiofilms. J Bacteriol, 2004, 186(6): 1838–1850.

[9] Dai L, Yang L, Parsons C, et al.recovered from indwelling catheters exhibit enhanced biofilm dispersal and “self-renewal” through downregulation of agr. BMC Microbiol, 2012, 12(1): 102.

[10] Schaber JA, Carty NL, Mcdonald NA, et al. Analysis of quorum sensing-deficient clinical isolates of. J Med Microbiol, 2004, 53(9): 841–853.

[11] Sauer K, Cullen MC, Rickard AH, et al. Characterization of nutrient-induced dispersion inPAO1 biofilm. J Bacteriol, 2004, 186(21): 7312–7326.

[12] Whitehead NA, Barnard AML, Slater H, et al. Quorum-sensing in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Rev, 2001, 25(4): 365–404.

[13] Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol, 1994, 176(2): 269–275.

[14] Wang Y, Wang YX, Sun LY, et al. The LuxS/AI-2 system of. Appl Microbiol Biotechnol, 2018, 102(17): 7231–7238, doi: 10.1007/s00253-018-9170-7.

[15] Wang Y, Li Y, Zhang ZC, et al. Overexpression ofcannot increase autoinducer-2 production, only affect the growth and biofilm formation inSciWorldJ, 2013, 2013: 924276.

[16] Wang Y, Zhang W, Wu ZF, et al. Functional analysis ofinreveals a key role in biofilm formation and virulence. Vet Microbiol, 2011, 152(1/2): 151–160.

[17] Wang Y, Yi L, Wu ZF, et al. Comparative proteomic analysis ofbiofilms and planktonic cells that identified biofilm infection-related immunogenic proteins. PLoS ONE, 2012, 7(4): e33371.

[18] Wang Y, Yi L, Wang SH, et al. Crystal structure and identification of two key amino acids involved in AI-2 production and biofilm formation inLuxS. PLoS ONE, 2015, 10(10): e0138826.

[19] Valentini M, Filloux A. Biofilms and cyclic di-GMP (c-di-GMP) signaling: lessons fromand other bacteria. J Biol Chem, 2016, 291(24): 12547–12555.

[20] Galperin MY. Bacterial signal transduction network in a genomic perspective. Environ Microbiol, 2004, 6(6): 552–567.

[21] Díaz M, Castro M, Copaja S, et al. Biofilm Formation by the acidophile bacteriuminvolves c-di-GMP pathway and Pel exopolysaccharide. Genes, 2018, 9(2): 113.

[22] Francis VI, Stevenson EC, Porter SL. Two-component systems required for virulence in. FEMS Microbiol Lett, 2017, 364(11): fnx104.

[23] Meissner A, Wild V, Simm R, et al. 78cupA-encoded fimbriae expression is regulated by a GGDEF and EAL domain-dependent modulation of the intracellular level of cyclic diguanylate. Environ Microbiol, 2007, 9(10): 2475–2485.

[24] Rao F, Yang Y, Qi Y, et al. Catalytic Mechanism of Cyclic Di-GMP-specific phosphodiesterase: a Study of the EAL domain-containing RocR from. J Bacteriol, 2008, 190(10): 3622–3631.

[25] Kulasekara HD, Ventre I, Kulasekara BR, et al. A novel two-component system controls the expression offimbrial cup genes. Mol Microbiol, 2005, 55(2): 368–380.

[26] Irie Y, Starkey M, Edwards AN, et al.biofilm matrix polysaccharide Psl is regulated transcriptionally by RpoS and post-transcriptionally by RsmA. Mol Microbiol, 2010, 78(1): 158–172.

[27] Irie Y, Borlee BR, O’Connor JR, et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(50): 20632–20636.

[28] Hickman JW, Harwood CS. Identification of FleQ fromas ac-di-GMP-responsive transcription factor. Mol Microbiol, 2008, 69(2): 376–389.

[29] Lee VT, Matewish JM, Kessler JL, et al. A cyclic-di-GMP receptor required for bacterial exopolysaccharide production. Mol Microbiol, 2007, 65(6): 1474–1484.

[30] Klockgether J, Tümmler B. Recent advances in understandingas a pathogen. F1000Res, 2017, 61261.

[31] Guo XP, Sun YC. New insights into the non-orthodox two component rcs phosphorelay system. Front Microbiol, 2017, 8: 2014.

[32] Kay E, Humair B, Dénervaud V, et al. Two GacA-dependent small RNAs modulate the quorum-sensing response in. J Bacteriol, 2006, 188(16): 6026–6033.

[33] Lapouge K, Schubert M, Allain FH, et al. Gac/Rsm signal transduction pathway of gamma-proteobacteria: from RNA recognition to regulation of social behaviour. Mol Microbiol, 2008, 67(2): 241–253.

[34] Marden JN, Diaz MR, Walton WG, et al. An unusual CsrA family member operates in series with RsmA to amplify posttranscriptional responses in. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(37): 15055–15060.

[35] Bordi C, Marie-Cécile L, Ventre I, et al. Regulatory RNAs and the HptB/RetS signalling pathways fine-tune Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Mol Microbiol, 2010, 76(6):1427–1443.

[36] Petrova OE, Sauer K. The novel two-component regulatory system BfiSR regulates biofilm development by controlling the small RNA rsmZ through CafA. J Bacteriol, 2010, 192(20):5275–5288.

[37] O’Callaghan J, Reen FJ, Adams C, et al. Low oxygen induces the type III secretion system inmodulation of the small RNAs rsmZ and rsmY. Microbiology, 2011, 157(12):3417–3428.

[38] Balasubramanian D, Kumari H, Mathee K. Pseudomonas aeruginosa AmpR: an acute-chronic switch regulator. Pathogens & Disease, 2015, 73(2):1.

[39] Goodman AL, Merighi M, Hyodo M, et al. Direct interaction between sensor kinase proteins mediates acute and chronic disease phenotypes in a bacterial pathogen. Genes Dev, 2009, 23(2): 249–259.

[40] Chambonnier G, Roux L, Redelberger D, et al. The hybrid histidine kinase lads forms a multicomponent signal transduction system with the GacS/GacA two-component system in. PLoS Genetics, 2016, 12(5): e1006032.

[41] Broder UN, Jaeger T, Jenal U. LadS is a calcium-responsive kinase that induces acute-to-chronic virulence switch in. Nat Microbiol, 2016, 2: 16184.

[42] Miller CL, Romero M, Karna SL, et al. RsmW,small non-coding RsmA-binding RNA upregulated in biofilm versus planktonic growth conditions. BMC Microbiol, 2016, 16(1): 155.

[43] Mougous JD, Cuff ME, Raunser S, et al. A virulence locus ofencodes a protein secretion apparatus. Science, 2006, 312(5779): 1526–1530.

[44] Mikkelsen H, Mcmullan R, Filloux A. Thereference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS ONE, 2011, 6(12): e29113.

[45] Jimenez PN, Koch G, Thompson JA, et al. The multiple signaling systems regulating virulence in. Microbiol Mol Biol Rev, 2012, 76(1): 46–65.

Roles of signaling molecules in biofilm formation

Chuntian Tu1, Yang Wang1, Li Yi2, Yuxin Wang1, Baobao Liu1, and Shenglong Gong1

1 Key Laboratory of Molecular Pathogen and Immunology of Animal of Luoyang, College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China 2 College of Life Sciences, Luoyang Normal University, Luoyang 471022, Henan, China

Bacterial biofilm refers to a tunicate-like biological group composed of polysaccharide, protein and nucleic acid secreted by bacteria on the surface of the mucous membrane or biological material. The biofilm formation is a major cause of chronic infections. Bacteria could produce some secondary metabolites during the growth and reproduction. Some of them act as signaling molecules allowing bacteria to communicate and regulate many important physiological behaviors at multiple-cell level, such as bioluminescence, biofilm formation, motility and lifestyles. Usually, these signal molecules play an important role in the formation of bacterial biofilm. We review here the effects of related signal molecules of Quorum Sensing, cyclic diguanylate, Two-Component Systems and sRNA on the biofilm formation. Focusing on these regulation mechanism of signal molecules in the process of biofilm formation is necessary for the prevention and treatment of some chronic diseases.

biofilm, signaling molecules, quorum sensing, sRNA, c-di-GMP

10.13345/j.cjb.180326

August 10, 2018;

January 28, 2019

National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFD0500100), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31772761, 31540095), Science and Technology Development Project of Henan Province (Nos. 182300410047, 162300410067).

Yang Wang. Tel: +86-379-64282431; E-mail: wangyocean@163.com

國(guó)家十三五重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(No. 2018YFD0500100)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31772761，31540095)，河南省自然科學(xué)基金(Nos. 182300410047，162300410067) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)