壽胎丸對GnRHa控制性超促排卵著床期小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)及妊娠結(jié)局的影響

譚福紅，李 楠，張 輝，陳 梅

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，陜西 咸陽 712000）

控制性超促排卵(COH)是IVF-ET最常用的治療方案[1]。其優(yōu)點是提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、同步卵泡發(fā)育、募集更多成熟卵泡、防止早期LH峰值和降低周期取消率等[2]。但研究表明，COH可以影響子宮內(nèi)膜的形態(tài)和感受性[3]。壽胎丸作為補(bǔ)腎安胎的基礎(chǔ)方，出自清末明初著名醫(yī)家張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》。原方由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠四味藥物組成，張娟[4]等對2010～2015年有關(guān)與壽胎丸的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)其在婦科疾病治療方面有著廣泛的影響，除流產(chǎn)、月經(jīng)不調(diào)、多囊卵巢綜合征等方面外，也包含了輔助生殖技術(shù)。在藥理及毒理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)壽胎丸對妊娠期孕鼠生殖功能狀態(tài)未見明顯影響，未見鼠胎仔致畸形作用[5]。因此本文通過壽胎丸對控制性超促排卵著床期小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)及厚度的實驗研究，為壽胎丸在輔助生殖技術(shù)治療方面提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物

成熟未孕雌性ICR系SPF小鼠，6～8周齡，體重30±5g，清潔級：6～8周齡性成熟雄鼠體重30±5g，均由成都達(dá)碩實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（川）2015-030。室溫（20±2）℃，動物自由攝食、飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物

注射用醋酸亮丙瑞林微球（國藥準(zhǔn)字H20093852）、注射用尿促性素（HMG）（國藥準(zhǔn)字H10940097）、注射用絨促性素（HCG）（國藥準(zhǔn)字H44020674），均購自上海麗珠制藥有限公司。壽胎丸組方菟絲子120 g，桑寄生60 g，續(xù)斷60 g，阿膠60 g，均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，自來水浸泡30 min，根據(jù)小鼠等效計量相當(dāng)于人用劑量的9.1倍計算，煎煮濃縮藥物終濃度為1g生藥/ml混懸液，4℃冰箱保存。

1.1.3 主要試劑及儀器

蘇木素-伊紅（HE）染色液購自碧云天生物技術(shù)公司；4%多聚甲醛、無水乙醇、1%鹽酸分化液、二甲苯、枸櫞酸緩沖鹽溶液（PBS）、光學(xué)顯微鏡（XSZ-81，廣西梧州市光學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法

將60只雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，按照隨機(jī)數(shù)字分為空白組、模型組、中藥組，每組20只。每日進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)觀察2個動情周期，將具有規(guī)律動情周期的小鼠納入本實驗研究。從第3個動情周期開始實驗。小鼠動情周期為4-5天，分為:動情前期（P）、動情期（E）、動情后期（M）、動情間期（DI），于動情前期參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行用藥。用藥劑量參照小鼠等效劑量相當(dāng)于人用劑量的9.1倍，計算小鼠灌胃劑量。

造模前，空白組、模型組按照1ml/100g灌服生理鹽水，1次/d，中藥組按照1ml/100g灌服中藥，1次/d。

造模開始，模型組及中藥組每日上午9時腹腔注射醋酸亮丙瑞林，劑量為1.5μg/100g體重，連續(xù)10天；第10天同時注射HMG，劑量為1IU/100g；造模第12天上午9：00腹腔注射HCG，劑量為10IU/100g。

造模結(jié)束當(dāng)日18：00按雌雄比例2:1合籠，合籠后D4天，3組各處死10只觀察妊娠數(shù)并取子宮觀察內(nèi)膜厚度和形態(tài)學(xué)變化。剩余小鼠于D7處死，觀察各組的總?cè)焉锫省?/p>

1.2.2 HE染色觀察著床窗口期子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化

小鼠斷頸處死，剖取小鼠子宮，放置于4%多聚甲醛中固定24h。將脫水包埋后的組織用切片機(jī)，切成3 um，展片后撈片烘干、脫蠟，依次按照二甲苯①15 min→二甲苯② 15 min→100%乙醇3 min→90%乙醇3min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→自來水沖洗3 min→蒸餾水浸泡6 min后開始HE染色。擦干蒸餾水，蘇木素染色10 min→1%鹽酸分化液10s，流水沖洗15 min→蒸餾水沖洗3s，伊紅染色1 min，依次按照75%、85%、95%、100%乙醇脫水各3 min，二甲苯①5 min→二甲苯②3 min，擦干二甲苯后中性樹脂封片。待中性樹脂干燥后顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜形體學(xué)變化。顯微鏡下觀察著床窗口期子宮內(nèi)膜厚度及腺體的周長、面積和最大直徑。測量采用Lecia Qwin Plus 圖像處理軟件進(jìn)行處理。

1.2.3 妊娠率的計算

合籠后D4、D7各組處死10只小鼠，摘取子宮，記錄孕鼠數(shù)。生理鹽水沖洗子宮，體式顯微鏡下觀察是否有胚胎，檢見胚胎者視為孕鼠，無胚胎者視為未孕。妊娠率（%）=（孕鼠數(shù)/交配雌鼠數(shù)）×100%。

1.2.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)學(xué)的變化

由表1可以看出，合籠后D4空白組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），模型組子宮內(nèi)膜厚度變薄，腺體周長、面積和最大直徑均小于中藥組（P＜0.05）。鏡下觀察到空白組小鼠子宮內(nèi)膜腺體豐富、腺腔分泌充分、間質(zhì)疏松。模型組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量較少、腺腔直徑較小且分泌不足、間質(zhì)水腫，內(nèi)膜與間質(zhì)發(fā)育不同步。中藥組子宮內(nèi)膜發(fā)育較模型組成熟，腺體數(shù)目、腺腔直徑及分泌程度、間質(zhì)疏松接近空白組。（圖1）

表1 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)學(xué)的比較（x±s）

圖1 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化（HE×200）

2.2 3組小鼠總?cè)焉锫实谋容^

模型組的總?cè)焉锫逝c對照組和中藥組相比較，存在顯著性差異（P＜0.05）?？瞻捉M與模型組之間的總?cè)焉锫蚀嬖陲@著性差異（P＞0.05）。

表2 3組小鼠妊娠率的比較

3 討 論

控制性超促排卵是IVF-ET中最常見的治療方案，歸納為：單用克羅米芬、單純促排卵（HMG+HCG）和GnRHa+HMG+HCG，根據(jù)馬永臻[7]的臨床試驗研究，認(rèn)為三者相比較而言，GnRHa+HMG+HCG方案對子宮內(nèi)膜的影響最小，內(nèi)膜與間質(zhì)的同步性較其它兩種一致性最好，著床率較高。馬艷華[8]對控制性超促排卵對子宮內(nèi)膜的影響情況進(jìn)行綜述，歸納為三個方面，包括子宮內(nèi)膜組織學(xué)改變、超微結(jié)構(gòu)胞飲突表達(dá)異常、子宮內(nèi)膜激素受體表達(dá)異常等，其中子宮內(nèi)膜組織學(xué)包括組織分日與生理不符、腺體發(fā)育與間質(zhì)發(fā)育不同步性，而這一研究最為直觀的反應(yīng)COH對子宮內(nèi)膜的影響，因此本實驗采用GnRHa+HMG+HCG作為COH方案，將子宮內(nèi)膜形態(tài)變化、厚度作為檢測指標(biāo)。

近年來利用現(xiàn)代科學(xué)研究，關(guān)于壽胎丸的研究十分廣泛[9-15]，關(guān)于生殖醫(yī)學(xué)方面，各研究均認(rèn)為壽胎丸加減可以改善COH后大/小鼠子宮內(nèi)膜的容受性。本研究觀察了壽胎丸基礎(chǔ)方對GnRHa控制性超促排著床期子宮內(nèi)膜的厚度及形態(tài)學(xué)的改變，結(jié)果顯示經(jīng)壽胎丸治療后，著床期子宮內(nèi)膜厚度較模型組明顯增加，受抑制的內(nèi)膜得到了逆轉(zhuǎn)。形態(tài)學(xué)上子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量豐富、腺腔增大、腺腔分泌充分，間質(zhì)輕度疏松，內(nèi)膜與腺體的發(fā)育基本同步。從最終各組的總?cè)焉锫手幸沧C實了中藥干預(yù)后的效果，中藥組的妊娠率高于模型組，表明壽胎丸對胚胎的粘附和植入過程中子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境有正向調(diào)節(jié)作用。這一研究對今后臨床用藥起到了指導(dǎo)作用。