基于反射光譜特征的肝組織熱損傷動(dòng)態(tài)分析*

趙金哲,王娟,晉曉飛,錢(qián)志余△,李韙韜，劉珈

(1.南京航空航天大學(xué) 自動(dòng)化學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程系，南京 211106； 2.湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410013)

1 引 言

微波消融和射頻消融作為兩種主要的介入式微創(chuàng)熱消融手段，已經(jīng)成為早期肝癌的常用治療方式[1]。肝癌消融治療中，術(shù)中消融邊界監(jiān)控是實(shí)時(shí)評(píng)估消融療效的主要方法之一[2]。由于生物組織熱損傷取決于溫度和時(shí)間兩方面的因素，而目前以溫度為主要參數(shù)的術(shù)中監(jiān)測(cè)方法，無(wú)法從熱損傷本質(zhì)上反映出組織毀損程度，其評(píng)價(jià)指標(biāo)往往依靠醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定[3]。因此，尋找一種更加準(zhǔn)確、靈敏的術(shù)中療效評(píng)估手段是熱消融治療研究的重要方向之一。

近紅外光譜技術(shù)是利用人體組織內(nèi)不同物質(zhì)在近紅外波段吸收、散射等特性的差異來(lái)分析組織成分和功能的常用手段，具有簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)等技術(shù)優(yōu)勢(shì)[4]。應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行消融損傷分析為消融手術(shù)實(shí)時(shí)療效評(píng)估提供了一種便捷的解決方案。許多研究者針對(duì)肝組織熱損傷前后的光譜變化進(jìn)行了分析。Ritz等[5]對(duì)比了新鮮和消融凝固肝組織在400～2400 nm波段的吸收、散射特性差異；Lin等[6]和Buttermere等[7]分析了消融過(guò)程肝組織熒光光譜和反射光譜的變化，并采用特征峰值來(lái)反映組織熱損傷進(jìn)展；Yoshimura等[8]將反射光譜強(qiáng)度與熱損傷動(dòng)態(tài)過(guò)程相聯(lián)系并分析了肝組織的熱損傷參數(shù)；戴麗娟等[9]采用830～900 nm波段的反射光譜斜率來(lái)表征肝組織熱損傷程度。前期研究中，我們也驗(yàn)證了以光譜分析方法推導(dǎo)得到的約化散射系數(shù)(Reduced Scattering Coefficient)來(lái)評(píng)估肝組織消融損傷程度的可行性，并以之測(cè)定了肝組織熱損傷參數(shù)[10-11]。

上述研究表明，熱損傷使肝組織產(chǎn)生的宏觀光學(xué)特性改變較為明顯，反射光譜強(qiáng)度或以之推導(dǎo)得到的評(píng)估參數(shù)與熱損傷程度有密切關(guān)聯(lián)。然而，以光譜分析方法來(lái)衡量不同物質(zhì)的變性程度或識(shí)別損傷產(chǎn)物則更利于消融療效評(píng)價(jià)。針對(duì)該問(wèn)題，Spliethoff等[12]和Tanis等[13]采集了熱損傷前后血液和肝腫瘤的近紅外光譜，以光譜形狀變化識(shí)別高鐵血紅蛋白(Methemoglobin)的產(chǎn)生，并以光譜導(dǎo)數(shù)特征峰的比值評(píng)價(jià)熱損傷。但是，這種分析方式容易受到光譜斜率變化的影響，其評(píng)估參數(shù)對(duì)血紅蛋白變性的動(dòng)態(tài)過(guò)程表征不夠連續(xù)。因此，如何在采用簡(jiǎn)便測(cè)量方法的同時(shí)動(dòng)態(tài)分析組織主要物質(zhì)的熱損傷過(guò)程仍有待研究。

在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，我們采用近紅外光譜技術(shù)分析肝組織熱損傷過(guò)程中不同波長(zhǎng)下反射光強(qiáng)的變化速率，并討論了其在不同溫度下的動(dòng)態(tài)差異與組織血紅蛋白熱損傷進(jìn)程的關(guān)聯(lián)，以驗(yàn)證將其用于消融熱損傷進(jìn)程評(píng)估的可行性。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成

實(shí)驗(yàn)材料為當(dāng)日獲取的新鮮離體豬肝，均勻選取無(wú)較大血管的部分切成長(zhǎng)約5 cm的條狀并置于無(wú)菌試管中。實(shí)驗(yàn)采用恒溫水浴方式對(duì)肝組織進(jìn)行熱致?lián)p處理，恒溫水浴溫度分別設(shè)置為60 ℃、70 ℃和80 ℃，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)1次以驗(yàn)證結(jié)果，共進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，各組實(shí)驗(yàn)采用的樣本均來(lái)自同一豬肝。

實(shí)驗(yàn)采用的光譜采集系統(tǒng)主要包含光纖光譜儀(USB2000，海洋光學(xué)，美國(guó))、鹵素光源(HL-2000，海洋光學(xué)，美國(guó))和雙光纖探頭，其中雙光纖探頭由相同的兩根單模光纖組成，芯徑均為200 μm，中心間距為200 μm。溫度監(jiān)測(cè)采用自制測(cè)溫探針，探針頂端內(nèi)置熱敏電阻(芝浦，日本)，測(cè)溫針連接至單片機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)鉑電阻校準(zhǔn)后測(cè)溫精度為±0.5 ℃。

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)前，將雙光纖探頭和測(cè)溫針緊密并列，經(jīng)試管橡皮塞插入豬肝中約7 cm并固定。將試管置入設(shè)定好溫度的水浴鍋中開(kāi)始加熱，同時(shí)開(kāi)始記錄光譜與溫度數(shù)據(jù)變化。不同恒溫水浴中保持時(shí)間分別為：60 ℃下加熱10 min，70 ℃下加熱8 min，80 ℃下加熱6 min。達(dá)到時(shí)間后停止數(shù)據(jù)采集并取出試管。

圖1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成

2.2 數(shù)據(jù)采集與處理

光譜和溫度采樣頻率為1 Hz，由計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)記錄數(shù)據(jù)并處理。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先采集光學(xué)白板的反射光譜作為參考光譜，記為R0(λ)，之后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)并保持光譜儀積分時(shí)間不變。參考光譜R0(λ)和實(shí)驗(yàn)采集的原始光譜Rraw(λ)采用低通濾波器去噪后，將Rraw(λ)與R0(λ)相除，以補(bǔ)償鹵素光源不同波長(zhǎng)光強(qiáng)的差異：

(1)

為了分析不同波長(zhǎng)λi處的反射光強(qiáng)在熱損傷過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化速率的差異，將不同時(shí)刻t的R(t, λi)對(duì)所有加熱時(shí)間歸一化：

(2)

其中，NR(t, λi)為t時(shí)刻λi處歸一化反射光強(qiáng)，min(R(λi))和max(R(λi))分別為熱損傷過(guò)程R(λi)的最小值和最大值。因此，t時(shí)刻的歸一化反射光譜為NR(λ)。由于不同波長(zhǎng)處的反射光強(qiáng)與組織不同物質(zhì)在該波長(zhǎng)處的吸收和散射特性有關(guān)，其在熱損傷過(guò)程的損傷程度與速率可能并不一致。因此，進(jìn)一步將NR(λ)對(duì)波長(zhǎng)求差分，可以分析各時(shí)刻不同波長(zhǎng)反射光強(qiáng)的差異：

(3)

根據(jù)NR和ΔNR的變化,可以觀察損傷過(guò)程中組織不同波段反射光譜的動(dòng)態(tài)變化特性。同時(shí)，將NR與ΔNR變化速率出現(xiàn)差異的波長(zhǎng)與不同血紅蛋白的吸收峰值[14](圖2)比較，可以進(jìn)一步分析其與血紅蛋白熱損傷變性的關(guān)聯(lián)。

3 結(jié)果與討論

3.1 反射光譜變化

實(shí)驗(yàn)中組織反射光譜R的變化見(jiàn)圖3，隨著熱損傷的產(chǎn)生，光譜強(qiáng)度逐漸增加。其中520～600 nm左右的波谷主要對(duì)應(yīng)為血紅蛋白的吸收。在所設(shè)定的三個(gè)加熱溫度下，加熱結(jié)束時(shí)反射光譜的最大強(qiáng)度隨溫度增大，略有增加，不同波段光譜強(qiáng)度相對(duì)變化并不一致。

圖2 含氧血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的特征吸收譜

Fig2Characteristicabsorbancespectraofoxyhemoglobinanddeoxyhemoglobin

圖3肝組織熱損傷過(guò)程的反射光譜變化

Fig3Liverreflectancespectrumchangesduringthermaldamageprogress

3.2 反射光譜變化速率與熱損傷動(dòng)態(tài)分析

熱損傷過(guò)程的歸一化反射光譜NR見(jiàn)圖4(a)，不同溫度實(shí)驗(yàn)組中光譜變化速率不同。隨著溫度升高，光譜變化速率顯著增加。60 ℃下NR在加熱結(jié)束時(shí)達(dá)到最大強(qiáng)度，而70 ℃和80 ℃組短波段NR在達(dá)到最大值后略有下降，這可能是高溫作用下吸光色團(tuán)的進(jìn)一步變性。各組實(shí)驗(yàn)中，同一時(shí)刻的NR曲面并不光滑，說(shuō)明不同波長(zhǎng)處的NR變化程度并不一致，這可以從光譜差分ΔNR的變化中明顯觀察到(見(jiàn)圖4(b))。同組實(shí)驗(yàn)中，隨著溫度升高，ΔNR出現(xiàn)了明顯的峰值變化，即不同波長(zhǎng)下NR的變化速率開(kāi)始出現(xiàn)差別。在70 ℃和80 ℃組中這一差別更加明顯，且由于最高加熱溫度和升溫速率的不同，ΔNR變化速率也不相同，80 ℃組中峰值變化更迅速。

這一結(jié)果可以由肝組織不同物質(zhì)受熱損傷速率的差異來(lái)說(shuō)明。對(duì)某一波長(zhǎng)處的反射光譜R(λ)來(lái)說(shuō)，其強(qiáng)度取決于肝組織各種物質(zhì)吸收和散射特性的疊加，當(dāng)某一物質(zhì)發(fā)生變性時(shí)，R(λ)也會(huì)隨之改變。進(jìn)一步，NR(λ)表達(dá)了整個(gè)熱損傷過(guò)程中這一波長(zhǎng)下反射光強(qiáng)的變化進(jìn)程，其變化速率也決定于不同物質(zhì)受熱變性的速率的疊加。而對(duì)于具有不同光學(xué)特性的物質(zhì)來(lái)說(shuō)，以含氧血紅蛋白(oxyhemoglobin, oxyHb)和脫氧血紅蛋白(deoxyhemoglobin, deoxyHb)為例，若t時(shí)刻其對(duì)NR(λ)的影響分?jǐn)?shù)分別表示為ωoxyHb(λ)和ωdeoxyHb(λ)，剩余濃度分別為CoxyHb(t)和CdeoxyHb(t)，則可以將NR(t,λ)寫(xiě)為：

NR(t,λ)=ωoxyHB(λ)·CoxyHB(t)+ωdeoxyHB(λ)·CdeoxyHB(t)

(4)

波長(zhǎng)λ1和λ2處變化速率分別為:

(5)

圖4 熱損傷過(guò)程歸一化反射光譜及光譜差分隨時(shí)間的變化

(6)

因?yàn)镹R對(duì)各個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行了歸一化，對(duì)于不同波長(zhǎng)λ1和λ2有:

ωoxyHB(λ1)+ωdeoxyHB(λ1)=ωoxyHB(λ2)+ωdeoxyHB(λ2)

(7)

因此，當(dāng)oxyHb和deoxyHb的受熱變性速率不一致，即dCoxyHb(t)/dt和dCdeoxyHb(t)/dt不相等時(shí)，dNR(t,λ1)/dt與dNR(t,λ1)/dt也不相等。若在某一波長(zhǎng)處ωoxyHb(λ)顯著大于ωdeoxyHb(λ)，則NR變化速率主要由oxyHb的熱變性速率決定，反之亦然。

由式(4)至式(7)的分析可以看出，NR的變化反映了肝組織主要吸收色團(tuán)(oxyHb和deoxyHb等)的變性速率差異和變性程度。為了分析各組實(shí)驗(yàn)中NR變化速率的差異與肝組織不同血紅蛋白峰值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將NR變化的等高線圖與ΔNR峰值所在波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的變化曲線進(jìn)行對(duì)照，見(jiàn)圖5。從NR等高線圖中可以看出，三組實(shí)驗(yàn)中，60 ℃組和70 ℃、80 ℃兩組變化速率差別較大。與圖2中oxyHb和deoxyHb的特征吸收峰對(duì)照可以發(fā)現(xiàn)，70 ℃組中578 nm、543 nm和80 ℃組中579 nm、536 nm的速率差對(duì)應(yīng)oxyHb的吸收峰，556 nm處的速率差對(duì)應(yīng)deoxyHb的吸收峰。而60 ℃組未達(dá)到oxyHb和deoxyHb發(fā)生明顯熱損傷變性的溫度范圍[15-16]，紅細(xì)胞形態(tài)、肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)等變化間接引起oxyHb和deoxyHb對(duì)NR的影響，可能是該實(shí)驗(yàn)組569 nm 附近產(chǎn)生速率差的主要原因。此外，由于溫度過(guò)高時(shí)高鐵血紅蛋白(methemoglobin, metHb)的產(chǎn)生，70 ℃和80 ℃組中621 nm和780 nm處的速率差可能由于metHb和deoxyHb吸收強(qiáng)度的相對(duì)變化引起[13, 17]。

不同溫度下ΔNR隨時(shí)間改變的曲線更加明顯地反映了NR變化速率的差異。圖4(b)中ΔNR的波峰、波谷所在波長(zhǎng)值及該波長(zhǎng)下的ΔNR變化見(jiàn)圖5。三組實(shí)驗(yàn)中，70 ℃組和80 ℃組中ΔNR波峰和波谷所在的波長(zhǎng)值相同，而60 ℃組則與之有所差別。60 ℃組中，隨著溫度升高，594 nm處ΔNR變化明顯，其余各波長(zhǎng)變化較小。70 ℃和80 ℃組中各波長(zhǎng)ΔNR均呈先增后減的變化趨勢(shì)，且80 ℃組由于溫升速率較大，這種趨勢(shì)隨時(shí)間變化更加迅速。由于ΔNR變化與組織物質(zhì)發(fā)生熱損傷反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，ΔNR明顯變化的范圍即反映了熱損傷迅速進(jìn)行的范圍。當(dāng)ΔNR達(dá)到最大值時(shí)，損傷反應(yīng)速率達(dá)到最大值；當(dāng)ΔNR減小并接近0時(shí)，該溫度下?lián)p傷反應(yīng)接近飽和。因此，通過(guò)ΔNR各峰值曲線的位置和變化速率能夠準(zhǔn)確判斷熱損傷進(jìn)行的程度與變化趨勢(shì)，并可以具體觀察oxyHb和deoxyHb的熱變性過(guò)程，從而避免了難以從反射光譜中直接辨別不同物質(zhì)變性程度的缺點(diǎn)。

圖5歸一化反射光譜變化的等高線圖及其差分特征峰隨時(shí)間和溫度的變化曲線

Fig5Contourofnormalizedreflectancespectrumandchangesofpeakvaluesofspectrumdifferentialovertimeandtemperature

4 結(jié)論

本研究采用近紅外光譜技術(shù)，分析了不同溫度下肝組織熱損傷過(guò)程的反射光譜動(dòng)態(tài)變化特征，并將這些動(dòng)態(tài)變化特征與肝組織在可見(jiàn)-近紅外波段的主要吸光物質(zhì)，如oxyHb、deoxyHb的吸收光譜特征和熱變性過(guò)程聯(lián)系起來(lái)，從而以反射光譜動(dòng)態(tài)變化速率上的差異來(lái)評(píng)估肝組織的熱損傷程度。本研究采用的分析方法有助于利用近紅外光譜技術(shù)區(qū)分組織不同物質(zhì)的熱損傷進(jìn)程，并應(yīng)用于消融治療中消融邊界的監(jiān)測(cè)和消融療效評(píng)估，從而提高消融手術(shù)的成功率。