纖維素分解菌的分離篩選及特性研究

楊偉平，郭雷鋒，赫 倩

（洛陽師范學院生命科學學院，河南洛陽 471934）

農(nóng)作物秸稈作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品，是我國重要的生物資源[1]。2016年我國農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量達81 565.30萬t[2]，但因含有大量木質(zhì)素導致很難被充分利用。目前，秸稈雖然作為燃料、飼料和肥料和造紙工業(yè)的原料被利用，但當前農(nóng)作物秸稈焚燒量依然占27%[2]。

纖維素分解菌具有降解纖維素的能力，在提高秸稈利用效率方面具有一定的市場前景。王加友等[1]利用從土壤中分離到的1株纖維分解菌SY-403對玉米秸稈處理40 d時，秸稈的纖維素分解率達55.26%。美合熱阿依·木臺力甫[3]將2株乳酸菌與2株纖維素分解菌等比例混合后作為添加劑進行青貯發(fā)酵，發(fā)酵飼料的品質(zhì)明顯提高，動物對干物質(zhì)和中性洗滌纖維的消化率也顯著增高。黃旺洲[4]將分離到的纖維素分解菌群用于豬糞和牛糞的堆肥，發(fā)現(xiàn)纖維素分解菌群不僅能脫水、控制發(fā)酵過程的pH、使糞便中粗纖維和有機質(zhì)被有力分解和降解，也可抑制糞便中NH3及H2S的釋放。

鵝是草食性動物，不僅具有發(fā)達的盲腸，其腸道內(nèi)也存在著大量微生物，在利用粗纖維方面具有較大優(yōu)勢[5]。本試驗以鵝的新鮮糞便為材料，分離篩選高效降解纖維素的細菌并研究其特性，為動物微生態(tài)制劑、生物堆肥和除臭劑研究提供菌種資源和基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 本試驗中所用鵝的新鮮糞便采集于洛陽師范學院伊濱校區(qū)月明湖畔。采集糞便時，除去其表面的雜草和泥土，取中間部分，裝封口塑料袋中，排氣封口，編號，放入干凈的泡沫盒中在短時間內(nèi)帶回實驗室并進行纖維素細菌的分離。用于除臭試驗的雞糞便采集于洛陽市伊濱區(qū)某養(yǎng)雞場。

致病性大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為洛陽師范學院生命科學學院動物營養(yǎng)與健康調(diào)控研究室所保存。

1.2 培養(yǎng)基配制 纖維素分解菌的分離篩選培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基的配制見文獻[6]。

1.3 儀器 主要設備為萊卡正置熒光顯微鏡、BIOTEK Synergy H1型酶標儀、臺式高速冷凍離心機、Eppendorf PCR擴增儀、恒溫培養(yǎng)箱、凝膠成像分析儀、立式高壓蒸氣滅菌鍋等。

1.4 纖維素分解菌的初篩[6]稱取1.0 g鵝的新鮮糞便，轉(zhuǎn)移至一滅菌的三角瓶中，加入無菌水至100 mL刻度處，在80℃恒溫水浴鍋中振蕩30 min，即為糞便內(nèi)容物10-2的稀釋液，將此液繼續(xù)進行梯度稀釋，然后涂板、培養(yǎng)、剛果紅染色[7]，最后挑取菌落周圍透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）比值大的菌落，接種至無菌的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在LB+1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的平板上劃線分離純化培養(yǎng)2～3代，將純化后的菌種轉(zhuǎn)至斜面LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 纖維素分解菌的復篩 將初篩純化后的纖維素分解菌的菌液濃度調(diào)至OD600為0.5左右，按1%接種量接種于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)28 h，5 000 r/min、4℃條件下離心發(fā)酵液15 min，其上清液即為粗酶液，最終以測得的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性高低作為復篩纖維素分解菌的標準。

CMCase活力的測定參照《飼料添加劑 纖維素酶活力的測定》（NY/T 912-2004），即分光光度法測定飼料添加劑中纖維素酶活力。其中，CMCase的酶活力單位用U/mL表示，定義：CMCase與底物CMC-Na在pH 5.5、40℃條件下反應30 min，每分鐘由底物CMCNa降解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量。

1.6 纖維素分解菌的鑒定方法

1.6.1 形態(tài)學鑒定 采用革蘭氏染色法，觀察分離到的纖維素分解菌在顯微鏡下的形態(tài)和染色特征，染色方法參照錢存柔等[8]的方法進行。

1.6.2 纖維素分解菌的16S rRNA基因鑒定 CTAB/NaCl法提取細菌基因組DNA[9]，然后以細菌基因組DNA為模板，使用細菌通用引物27F/1492R進行細菌16S rRNA基因擴增。PCR反應體系（25 μL）：DNA模板 1 μL（50～100 ng/μL），上、下游引（10 pmol /μL）物各 1 μL，2×PCR Master Mix 酶 12.5 μL，無離子水補足至25 μL。PCR擴增條件：95℃預變性3 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，50 s；30個循環(huán)；72℃延伸5 min。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因。將檢測正確的PCR產(chǎn)物送至北京中科希林生物科技有限責任公司進行測序。測序結(jié)果在NCBI上用BLAST程序與GenBank中16S rRNA基因序列進行同源性分析。用Mega5.1中的鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 纖維素分解菌的特性研究

1.7.1 耐熱性[6]將培養(yǎng)至24 h的纖維素分解菌（OD600=0.5）分別置于55、65、75、85℃水浴中處理30 min后用流水迅速冷卻，以未經(jīng)過熱處理的菌液作為對照，采用平板計數(shù)法，根據(jù)其存活率評價纖維素分解菌的耐熱能力。

1.7.2 抑菌特性 將試驗用的纖維素分解菌液（OD600=0.5）以1%接種量接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃160 r/min震蕩培養(yǎng)30 h后，12 000 r/min離心2 min，上清液備用。抑菌試驗采用牛津杯法[6]。

1.7.3 除臭特性 稱200 g新鮮的雞糞便置于干凈的塑料瓶中，以5%的接種量向瓶中添加濃度為1.0×108CFU/mL的纖維素分解菌、攪拌均勻，作為試驗組，每組做3個平行。試驗前排出發(fā)酵瓶中多余氣體，將集氣管一端連接裝糞便的瓶子（集氣管連接處密閉），另一端連接一定體積的集氣袋收集氣體，然后置于37℃的水浴鍋中發(fā)酵10 h并收集氣體。對照組以無菌水代替纖維素分解菌。試驗中NH3和H2S產(chǎn)量的測定分別采用納氏分光光度法《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第2部分：化學污染物》（GBT-18204.2-2014）和《天然氣中硫化氫含量的測定 碘量法 GB/T 11060.1-1998》進行，并計算該纖維素菌對雞糞便所產(chǎn)NH3和H2S的去除率。

1.8 統(tǒng)計分析 采用Excel整理試驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件中Dancan′s法進行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 纖維素分解菌的篩選 采用剛果紅染色法初篩，發(fā)現(xiàn)在來自鵝糞便中的多株菌的菌落周圍都產(chǎn)生了清晰的透明圈。進一步將初篩到的菌株反復劃線純化培養(yǎng)、剛果紅染色，比較不同菌株菌落的形態(tài)大小、D/d值以及CMCase活性，最終確定將編號為G-6、D/d值為4.8（透明圈直徑為2.4 cm、菌落直徑為0.5 cm）以及CMCase為0.37 U/mL的纖維素分解菌用于后續(xù)試驗（圖1）。

圖1 試驗菌株G-6在CMC-Na板上的水解圈

2.2 菌株G-6的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 通過反復分離純化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌株G-6為乳白色，大小均一、表面有褶皺，周邊呈鋸齒狀結(jié)構(gòu)（圖2A）。革蘭氏染色陽性、桿狀，且有芽孢（圖2B）。

圖2 菌株G-6的形態(tài)特征和革蘭氏染色結(jié)果

圖4 菌株G-6 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 16S rRNA 基因鑒定 以試驗菌株G-6基因組DNA為模板，進行16S rRNA基因的PCR擴增，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到1 500 bp的目的條帶，其大小與預期結(jié)果基本一致（圖3）。將測序結(jié)果在NCBI里用BLAST程序?qū)υ囼灳甑?6S rRNA基因序列進行比對，通過Mega6.0構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹進行同源性分析發(fā)現(xiàn)（圖4），該試驗菌株為芽孢桿菌屬的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌，命名為 Bacillus methylotrophic strain G-6。

2.3 Bacillus methylotrophic strain G-6的特性

2.3.1 耐熱性 通過耐熱試驗發(fā)現(xiàn)（表1），隨著溫度的升高，Bacillus methylotrophic strain G-6的存活率呈下降趨勢，但仍表現(xiàn)出較強的耐熱性。其中Bacillus methylotrophic strain G-6在55℃和65℃時的存活率顯著高于75℃和 85℃（P＜0.05）。

圖3 菌株G-6 的16S rRNA基因瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 Bacillus methylotrophic strain G-6的耐熱性（n=3）

2.3.2 抑菌特性 通過抑菌試驗（圖5）可知，Bacillus methylotrophic strain G-6對2種致病菌均表現(xiàn)出了一定的抑菌作用。其中，該試驗菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為13.63、16.17 mm。顯著性分析表明，該菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性差異顯著（P＜0.05）。

2.3.3 除臭能力 由表2可知，對照組糞便中H2S和NH3的產(chǎn)量分別為18.64、79.3 g/m3，而試驗組則分別為7.86 、56.14 g/m3，極顯著低于對照組（P＜0.01）。進一步分析表明，Bacillus methylotrophic strain G-6對雞糞便H2S、NH3的去除率分別達57.8%、29.26%。

圖5 Bacillus methylotrophic strain G-6的抑菌圖

表2 Bacillus methylotrophic strain G-6對H2S和NH3的去除效果（n=3）

3 討 論

3.1 纖維素分解菌的分離 普通固體培養(yǎng)基中添加CMC-Na、結(jié)合剛果紅染色法分離篩選纖維素分解菌，因簡單快捷、成本低等優(yōu)點被廣泛采用[10]。但CMC-Na平板篩選法因不能定量反映纖維素分解菌產(chǎn)CMCase的真實能力，需用菌株進行液體發(fā)酵，根據(jù)其產(chǎn)纖維素酶活的高低進行復篩[11]。本試驗篩選出了1株具有高效降解纖維素的菌株G-6，最終被鑒定為芽孢桿菌屬的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌，命名為Bacillus methylotrophicus G-6。以LB+1%CMC為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，Bacillus methylotrophicus G-6纖維素酶活性高達0.37 U/mL，低于張盼等[12]從土壤中以及關(guān)怡等[13]從森林公園下的濕潤木屑中分離到的纖維素分解菌，高于王彥偉等[14]從竹蟲幼蟲的腸道中分離到的纖維素分解菌的產(chǎn)酶能力。諸多研究發(fā)現(xiàn)，纖維素分解菌CMCase活性大小不僅與菌種及來源、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵培養(yǎng)時間、測定采用的標準方法等因素有關(guān)[12-15]，還與纖維素酶的酶反應條件（如底物和發(fā)酵酶液的濃度、溫度、時間、種子液濃度、接種量等因素）有關(guān)[15]。

3.2 Bacillus methylotrophicus G-6的特性 目前，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）主要用于作物病害防治[16]、生物表面活性劑[17]等方面的研究。此外，譚澤文等[18]研究發(fā)現(xiàn)從土壤中分離到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對餐廚垃圾具有防蠅產(chǎn)蛆效果。但該菌用在生物堆肥及除臭的研究上還很少。徐杰等[19]將分離到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌L1和枯草芽孢桿菌X9、解淀粉芽孢桿菌L8組成復合菌劑后用于牛糞的堆肥，結(jié)果顯示復合菌劑不僅對木質(zhì)纖維素有一定降解能力，而且具有使堆肥快速升溫和有效除臭的潛力。

本研究中，發(fā)現(xiàn)Bacillus methylotrophicus G-6菌株能耐受一定高溫，在55℃條件下其存活率達到90%以上，并且其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定抑制作用。此外，研究表明，NH3的揮發(fā)主要在堆肥前期（即升溫和高溫期）[20]，而H2S氣體的釋放量在不同動物糞便堆肥中釋放的早晚不同[21]。本試驗中，雞糞便在處理過程中NH3和H2S的產(chǎn)生與任順榮等[22]的研究結(jié)果基本一致，即初期H2S產(chǎn)量少，而NH3產(chǎn)量大。Bacillus methylotrophicus G-6對雞糞中H2S和NH3的去除率分別達57.81%和29.26%，低于張宏才等[23]從雞糞便中分離到的紅平紅球菌對NH3和H2S的去除率，但高于許啟有等[24]從豬糞便中分離到的短狀桿菌屬細菌X-3d等對NH3和H2S的去除率。由此可見，除臭菌的除臭效果不僅與其菌種及來源有很大關(guān)系，還與發(fā)酵初始pH、培養(yǎng)溫度及菌種接種量等有一定關(guān)系[23]。

4 結(jié) 論

本研究分離的纖維素分解菌為芽孢桿菌屬的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌，它不僅能夠分泌纖維素酶，而且具有耐高溫、抑菌、去除NH3和H2S的特性。因此，纖維素分解菌在微生物制劑、生物堆肥或者動物糞便除臭劑的研究中具有一定潛力，后期將針對它的特性進行更深入研究。