細(xì)辛揮發(fā)油環(huán)糊精包合物制備工藝的正交試驗(yàn)研究

郭誠(chéng)誠(chéng)，高爽，王玉真，謝慧超，馬學(xué)梅，容蓉，楊勇，李凌軍

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var.Mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq. var.seoulenseNakai或華細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根及根莖。前2種習(xí)稱(chēng)“遼細(xì)辛”[1]。根據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，細(xì)辛被列為上品，“細(xì)辛味辛、性溫，主咳嗽、頭痛腦動(dòng)、百節(jié)拘攣、風(fēng)濕痹痛、死肌，久服明目，利九竅輕身長(zhǎng)年”[2]?，F(xiàn)代研究表明，細(xì)辛的成分主要包括揮發(fā)性成分甲基丁香酚、黃樟醚、欖香酯素、細(xì)辛醚等以及非揮發(fā)性成分細(xì)辛脂素和馬兜鈴酸Ⅰ等[3]。其主要毒性成分為黃樟醚，不僅具有呼吸麻痹作用，而且是毒性較大的致癌物質(zhì)[4]。甲基丁香酚是細(xì)辛鎮(zhèn)咳祛痰、鎮(zhèn)痛和麻醉的主要藥效成分，而且也是含量最高的成分[5-6]，可作為藥材細(xì)辛的品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)[7]。揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定，在空氣中易揮發(fā)，且易氧化變質(zhì)，使得制劑在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中因揮發(fā)油的不穩(wěn)定性而變質(zhì)[8]，故用β-環(huán)糊精包合可增加穩(wěn)定性，提高生物利用度，并使揮發(fā)油固體粉末化，便于運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用，提高療效[9-10]。

本試驗(yàn)以甲基丁香酚包合率、載藥率及收得率的綜合評(píng)分作為衡量包合物優(yōu)劣的指標(biāo)[11]，通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)選了最佳包合工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限限公司)；Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱(瑞典Kromasil公司)；FA200AB型電子天平(賽多利斯有限公司)；H01-1A恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表有限公司)；KQ-250E超聲清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；飛鴿TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；IKA RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111642-200301)；細(xì)辛(濟(jì)南禾寶中藥材有限公司，批號(hào)16050202，生產(chǎn)日期2016.05.02)，產(chǎn)自遼寧，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt.var.mandshuricum( Maxim. )Kitag.的根莖；無(wú)水硫酸鈉；β-環(huán)糊精(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160308)；甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠)；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 大孔樹(shù)脂富集純化細(xì)辛揮發(fā)油

2.2 HPLC方法學(xué)考察

2.2.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫:30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm；進(jìn)樣量20 μL；以甲醇為流動(dòng)相A，純水為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～20 min，60%A→65%A；20～30 min，65%A→100% A；30～35 min，100%A→100%A；35～35.1 min，100%A→60%A；35.1～45 min，60%A→60%A)。對(duì)照品及樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram

2.2.2 甲基丁香酚對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品100.05 mg置于100 mL容量瓶，加甲醇溶解稀釋定容至刻度，搖勻，制成甲基丁香酚質(zhì)量濃度為1.000 5 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱(chēng)取揮發(fā)油包合物0.5 g，置錐形瓶?jī)?nèi)，加入25 mL甲醇，超聲60 min脫包合，抽濾，取續(xù)濾液1 mL置10 mL容量瓶?jī)?nèi)，甲醇定容至刻度，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，可得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密移取對(duì)照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL，分別置10 mL容量瓶?jī)?nèi)，甲醇稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制甲基丁香酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，甲基丁香酚回歸方程為y=17 642x+13.032，R2=0.999 3，在0.500 3 μg/mL～5.002 5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的積分值呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖2。

圖2 甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of methyl eugenol

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，照2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果甲基丁香酚平均峰面積為2 613.30，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h，照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果甲基丁香酚平均峰面積為6 693.70，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

制備供試品溶液6份，照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果甲基丁香酚平均峰面積為2 225.95，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%(n=6)，表明該樣品處理方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率考察

精密移取已知甲基丁香酚含量的供試品溶液0.5 mL，置10 mL容量瓶?jī)?nèi)，精密加入甲基丁香酚對(duì)照品200 μL，照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果甲基丁香酚的平均回收率為103.90%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 β-環(huán)糊精飽和水溶液法包合工藝研究

2.3.1 包合物的制備方法

采用飽和溶液法，取一定量β-環(huán)糊精與蒸餾水置錐形瓶?jī)?nèi)，在設(shè)定溫度下用磁力攪拌器制成飽和水溶液。精密移取細(xì)辛揮發(fā)油500 μL，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇1 mL溶解，緩慢滴加至環(huán)糊精飽和水溶液中，保溫?cái)嚢柚烈?guī)定時(shí)間。攪拌結(jié)束后，加適量乙醚4 ℃冷藏24 h。取出后抽濾，棄去濾液，用少量乙醚洗滌，置烘箱中40 ℃干燥5 h，得揮發(fā)油環(huán)糊精包合物，稱(chēng)定質(zhì)量。

2.3.2 單因素考察

2.3.2.1 乙醚對(duì)包合物收得率的影響

精密稱(chēng)取3 g β-環(huán)糊精 2份，置錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入78 mL蒸餾水，45 ℃下用磁力攪拌器攪拌至完全溶解。精密移取500 μL細(xì)辛揮發(fā)油2份，分別用1 mL 體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶解，緩慢滴加至環(huán)糊精水溶液中，保溫?cái)嚢柚烈?guī)定時(shí)間。攪拌結(jié)束后，樣品1加適量乙醚4 ℃冷藏24 h，樣品2不加乙醚4 ℃冷藏24 h。取出后抽濾，棄去濾液，用少量乙醚洗滌，40 ℃減壓干燥5 h，得揮發(fā)油環(huán)糊精包合物，稱(chēng)定質(zhì)量。稱(chēng)量后測(cè)定收得率，樣品1為76.12%，樣品2為60.06%。結(jié)果顯示，包合物冷藏時(shí)加適量乙醚，有利于包合物的形成。

2.3.2.2 乙醇含量對(duì)包合物脫包合的影響

精密稱(chēng)取0.5 g包合物3份，置錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入相同體積的體積分?jǐn)?shù)分別為95%、80%、65%乙醇溶解，超聲60 min脫包合，抽濾，取續(xù)濾液稀釋10倍，測(cè)定HPLC，計(jì)算甲基丁香酚包合率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)包合率影響

由此可以看出，脫包合時(shí)的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)甲基丁香酚包合率沒(méi)有太大影響，考慮到實(shí)際操作更加便捷，故選擇95%乙醇作為脫包溶劑。

2.3.2.3 脫包合方法的選擇

精密稱(chēng)取0.5 g包合物6份，置錐形瓶?jī)?nèi)，用25 mL 體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶解，分別采用超聲1 h后抽濾、超聲1 h后離心、超聲1 h后靜置、冷凝回流1 h后抽濾、冷凝回流1 h后離心、冷凝回流1 h后靜置的方法進(jìn)行脫包合。經(jīng)HPLC測(cè)定，計(jì)算空白回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 不同脫包合方法對(duì)空白回收率影響

由表2結(jié)果可知，超聲抽濾和回流離心的空白回收率較好，兩者差距不大，說(shuō)明揮發(fā)油損失率低，為使試驗(yàn)更加便捷，選擇超聲抽濾法進(jìn)行脫包合。

2.3.3 甲基丁香酚包合率、收得率及載藥率測(cè)定

取制備好的包合物，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中，y0為空白回收率；y1為甲基丁香酚包合率；y2為包合物收得率；y3為載藥率；x1為回收甲基丁香酚量；x2為投入甲基丁香酚量；x3為包合物中甲基丁香酚量；m1為包合物質(zhì)量；m2為β-環(huán)糊精投入量；m3為揮發(fā)油投入量。

2.3.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

綜合評(píng)分加權(quán)處理時(shí)，包合率是評(píng)價(jià)包合效果的主要指標(biāo)[12]，可以反映β-環(huán)糊精與揮發(fā)油量的關(guān)系，包合率愈高，包合效果愈好，影響揮發(fā)油穩(wěn)定性提高效果愈大，故權(quán)重系數(shù)定為0.5；收得率在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義，在投入量確定的情況下，收得率愈高，包合率愈高，將收得率作為次要指標(biāo)[13]，其權(quán)重系數(shù)定為0.3；載藥率也是控制包合質(zhì)量的重要因素，權(quán)重系數(shù)定為0.2。故按如下公式計(jì)算綜合評(píng)分(z)：

z=0.5y1+0.3y2+0.2y3。

通過(guò)多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，可較全面地反應(yīng)包合物的制備工藝水平,為揮發(fā)油制劑工藝的優(yōu)化及新劑型的研發(fā)提供新的參考理論依據(jù)。

2.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 因素水平表

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4

2.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3份細(xì)辛揮發(fā)油，按照最佳工藝進(jìn)行包合，包合物平均收得率為77.22%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.512%(n=3)；甲基丁香酚平均包合率為74.64%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.612%；平均載藥率為8.72%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%。說(shuō)明該條件下甲基丁香酚包合率、載藥率及包合物收得率比較穩(wěn)定，因此確定該工藝合理可行，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

(1)β-環(huán)糊精包合方法有飽和水溶液法、研磨法和超聲法，經(jīng)查閱文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)顯示，研磨法效果略?xún)?yōu)于飽和水溶液法，但工藝費(fèi)時(shí)費(fèi)力，超聲法效果最差，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中工業(yè)條件的限制，最終選擇飽和水溶液法進(jìn)行包合。

(2)曾采用水蒸氣蒸餾法測(cè)定包合物中揮發(fā)油含量，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空白回收率低，試驗(yàn)準(zhǔn)確性無(wú)法保證。故采用HPLC測(cè)定，通過(guò)綜合評(píng)分，能準(zhǔn)確反映出揮發(fā)油藥效物質(zhì)的包合效果。

(3)溫度對(duì)β-環(huán)糊精在水中的溶解度影響很大，隨著溫度的升高，β-環(huán)糊精溶解度越大，采用飽和水溶液法制備包合物時(shí), 要根據(jù)試驗(yàn)溫度下β-環(huán)糊精的在水中的溶解度計(jì)算所得加水量 , 使得包合過(guò)程在β-環(huán)糊精的飽和水溶液中進(jìn)行, 包合后低溫冷藏 , 以減少包合物的溶解 , 提高包合物的收率，可降低成本，減少服用量。大生產(chǎn)時(shí)應(yīng)注意未包合揮發(fā)油的回收。

(4)該方法甲基丁香酚包合率為74.64%，損失了25.36%，損失部分包含該方法本身的試驗(yàn)誤差4.94%(甲基丁香酚空白回收試驗(yàn)結(jié)果為95.06%)，所以實(shí)際試驗(yàn)中甲基丁香酚包合率要高于試驗(yàn)值。

(5)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，經(jīng)β-環(huán)糊精包合后，提高了揮發(fā)油中有效物質(zhì)甲基丁香酚的穩(wěn)定性并掩蓋了不良?xì)馕叮下瘦^高，而毒性物質(zhì)黃樟醚在經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂脫毒后，含量?jī)H余3.84%，經(jīng)β-環(huán)糊精包合后，釋放緩慢，降低其刺激作用。該方法操作簡(jiǎn)單，可用于工業(yè)化生產(chǎn)，也為進(jìn)一步的藥效評(píng)價(jià)和制劑工藝提供了質(zhì)量可控的包合工藝。