七子白皮膚毒性試驗

宋伶俐，李勇霖，王 強，趙 征，沈元朝，王廣澤，張 玥，許小琴

（揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009）

七子白組方始載于《太平圣惠方》[1]中，后見于《御藥院方》[2]，在古代深得后宮佳麗的喜愛，用此方來美膚養(yǎng)顏，可使面色光悅、膚若凝脂；時至今日，七子白仍被廣大女性喜愛，也不斷地被人們進行創(chuàng)新[3]，各種中藥美白配方中也能見到此方中的中藥。王冬艷[4]等人用改良七白膏進行美白功效探究，發(fā)現(xiàn)七白膏能降低血清中酪氨酸酶含量；在臨床上治療女性黃褐斑的臨床觀察中[5]，七子白治療有效率高達91.67%，梁偉等人也研究發(fā)現(xiàn)，七白顆粒對女性氣滯淤血型黃褐斑有明顯的療效[6]。

為了正確地評價七子白的安全性，本試驗選取了白色大鼠作為研究對象，進行了皮膚急性毒性試驗、刺激試驗和過敏試驗，為臨床提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試藥物：白術、白芷、白茯苓、白芍、白僵蠶、白蘞、白芨（均采購于毫州市伯世信主藥飲片有限公司），經揚州大學獸醫(yī)學院中獸醫(yī)教研室許小琴教授鑒定。所有藥物一起粉碎成粉末，過180 目篩子，備用。

1.2 主要試劑：2，4-二硝基氯代苯（上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司），凡士林。

1.3 主要器材：剃須刀，電子秤，醫(yī)用膠布、紗布。

1.4 受試動物：健康Wistar 白色大鼠，雌雄各半，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供。

2 試驗前準備

2.1 藥物準備：七子白用蒸餾水作為溶劑，將1.1 中的七子白粉末配制成0.5g/ml 的膏狀藥物備用；2，4-二硝基氯代苯配制成1%和0.1%的濃度備用。

2.2 動物皮膚準備 完整皮膚組：于給藥前24 小時，用剃毛刀將大鼠背肌對稱兩側去毛，去毛面積約為4×4cm，若在剃毛過程中皮膚有損傷，則不能參與完整皮膚組。

破損皮膚組：在完整皮膚組的基礎上進行操作，剃毛區(qū)用酒精消毒，再用磨砂紙打磨，以滲血為度。

3 試驗方法 參考《中藥藥理研究方法學》[7]第3 版的方法學，對七子白進行皮膚急性毒性試驗、刺激試驗和過敏試驗。

3.1 皮膚急性毒性試驗

3.1.1 試驗分組：將30 只大鼠隨機分為5 組，每組6 只(雌雄各半)，Ⅰ組為空白組、Ⅱ組為七子白完整皮膚高劑量組，Ⅲ組為七子白完整皮膚低劑量組，Ⅳ組為七子白破損皮膚高劑量組，Ⅴ組為七子白破損皮膚低劑量組。

3.1.2 給藥劑量及方法 給藥劑量Ⅰ組：凡士林；Ⅱ組和Ⅳ組：每只大鼠給予5g 七子白配制成的膏劑，Ⅲ組合Ⅴ組：每只大鼠給予1g 七子白配制的膏劑； 給藥方法為將各組對應藥物涂于剃毛區(qū)，用一層油紙兩層紗布，再用無刺激的醫(yī)用膠布固定（防止大鼠互相舔食以及讓藥物更好接觸皮膚），給藥24h 后洗去藥物，給藥一次。

3.1.3 觀察指標： 于洗去藥物后1h、24h、48h、72h 至第七天，每天仔細觀察大鼠運動行為、皮膚情況、有無死亡及全身毒性反應，若有死亡需剖解觀察臟器是否有病理變化。

3.2 皮膚刺激試驗

3.2.1 試驗動物分組： 將30 只大鼠隨機分為5 組，每組6只(雌雄各半)；A 組為空白組，B 組為七子白完整皮膚組，C組為七子白破損皮膚膚，D 組為陽性藥物完整皮膚組，E 組為陽性藥物破損皮膚組.

3.2.2 給藥劑量及方法：A 組：給與凡士林，B 組和C 組：給予1g 七子白粉制成的膏劑，D 組和E 組：給予1%的2，4-二硝基氯代苯0.5ml。

給藥方法 單次刺激試驗：給藥一次，給藥后用一層油紙和兩層紗布膠帶固定，給藥24h 后用溫水洗去藥物，觀察記錄給藥后1、24、48、72h 小時至第7 天。

多次刺激：按單次刺激試驗方法給藥，連續(xù)給藥7d，末次給藥后洗去藥物并觀察7d。

3.2.3 觀察指標：單次刺激和多次刺激給藥后，記錄大鼠背部皮膚每日的紅斑及水腫情況，記錄紅斑水腫發(fā)生時間大鼠數(shù)量及消退時間。按表3-1進行皮膚刺激評分，計算給組大鼠的刺激平均值，按表3-2評價各組藥物對皮膚的刺激強度。并仔細觀察實驗期間的大鼠運動行為、皮膚情況、有無死亡及全身毒性反應，若有死亡需剖解觀察臟器是否有病理變化。

3.3 皮膚過敏試驗

3.3.1 試驗動物分組： 將18 只大鼠隨機分為3 組，每組6只（雌雄各半），M 組為空白組、N 組為七子白組、L 組為陽性藥物組。

表3-1 皮膚刺激反應評分標準表

表3-2 皮膚刺激強度評價

3.3.2 給藥劑量及方法：M 組： 給予凡士林，N 組： 給予1g七子白粉配制成的膏劑，L 組： 給予1%的2，4-二硝基氯代苯0.5ml。

給藥方法：按給組對應藥物涂于剃毛區(qū)，用一層油紙兩層紗布以及無刺激醫(yī)用膠布固定，持續(xù)6h，在第7 天、第14 天分別用同樣方法重復一次，于末次致敏14 天后進行激發(fā)接觸(M 組和N 組同3.3.2，L 組為0.1%的2，4-二硝基氯代苯0.5ml)，6h 后洗去藥物。

3.3.3 觀察指標：觀察大鼠是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴重的全身過敏反應，按表3-3記錄給皮膚過敏反應并計算反應平均值，根據(jù)表3-4計算各組藥物致敏率并判斷致敏強度

3.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，采用F 檢驗對正交試驗結果進行差異顯著分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

表3-3 皮膚過敏反應評分標準

平均反應值=紅斑形成總分+水腫形成總分/合計動物數(shù)

表3-4 皮膚致敏性評價標準

4 試驗結果

4.1 皮膚急性毒性試驗

試驗結果顯示，在洗去藥物后至藥后7 天內各組皮膚未出現(xiàn)紅斑、水腫等毒性反應，大鼠精神狀態(tài)、行為活動、飲食、呼吸、眼和黏膜、糞便及分泌物均正常，大鼠無死亡，各組大鼠體重也無明顯變化。各組大鼠體重變化見表4-1。

表4-1 急性毒性試驗體重變化情況 g

4.2 皮膚刺激試驗

4.2.1 單次刺激試驗：由表4-2可見，給藥后7d 內，完整皮膚組和破損皮膚組未出現(xiàn)紅斑、 水腫和出血點等異常情況，各組大鼠皮膚健康，刺激反應評分為0，皮膚刺激強度平均分值為0，與空白組比無統(tǒng)計學意義。陽性藥物完整皮膚組和破損皮膚組皮膚出現(xiàn)輕微紅斑，一天后紅斑消失，刺激反應評分為1。

表4-2 皮膚刺激反應評分

4.2.2 多次刺激反應大鼠背部皮膚連續(xù)給藥7 天后，七子白完整皮膚組皮膚均無紅斑水腫等毒性反應，且與空白組相比，皮膚比空白組的白；七子白破損皮膚組的皮膚已恢復至正常；陽性藥物完整皮膚和破皮膚組大鼠皮膚嚴重紅斑，并有結痂，表明七子白無明顯刺激。詳細結果見圖1。

圖1 七子白多次刺激試驗結果

4.3 皮膚過敏反應

試驗結果表明，空白組、七子白組大鼠皮膚未見局部和全身過敏反應，與空白組比沒有差異，陽性藥物組給藥6h 洗去藥物后皮膚有輕微的紅斑，但無水腫，48h 后紅斑消失，此外各組大鼠行為活動、精神狀態(tài)等均正常，無全身過敏反應。大鼠無死亡。結果詳見表4-3、

5 分析與討論

本試驗中的七子白由白芨、白芷、白術、白茯苓、白僵蠶、白芍和白蘞七種“白”姓中藥組成，以上每種藥物按等劑量組成[8]，從中醫(yī)形象學來說，“白”姓藥物一般都具有增白潤色的作用，以色治色，借其色白來治皮膚暗沉等病癥。現(xiàn)代藥理研究表明： 白芷是一種抗氧化活性很強的中藥，它能抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性[9]，其有效成分香豆素能明顯抑制黑色素瘤B16 細胞中酪氨酸酶的合成[10]；在對小鼠四氯化碳（ccl4）誘導的肝臟損傷試驗中，白術多糖能增加超氧化物歧化酶 （SOD） 和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，降低丙二醛（MDA）和一氧化痰（NO）含量[11]；白芨中有很高的酚類化合物，能有效地清除氧自由基，延緩衰老和促進創(chuàng)傷愈合等作用[12，13]；白僵蠶水提醇沉法的提取物也能清除氧自由基[14]，所以臨床上常用來治療黃褐斑等皮膚病[15]；茯苓抗氧化的研究中發(fā)現(xiàn)[16]，茯苓能增強皮膚中羥脯氨酸含量，從而來延緩皮膚的衰老；在大鼠皮膚燙傷中實驗中，白蘞能更快更有效的傷口愈合活性，刺激肉芽組織增生[17]。從本次試驗多次試驗結果中可看出，七子白完整皮膚在連續(xù)給藥7 次后，大鼠皮膚比空白的白嫩，且七子白破損皮膚組的皮膚也愈合，說明七子白對皮膚不僅與美白的功效，還能促進傷口的愈合，與前人報道一致。

表4-3 皮膚過敏反應評分

本試驗結果顯示，七子白通過對大鼠的皮膚急性毒性試驗、刺激試驗(單次刺激和多次刺激)和過敏試驗（致敏接觸和激發(fā)接觸），均無毒性反應，無刺激，也未見明顯過敏反應，因此認為七子白是一個安全的皮膚外用藥方。