柑橘黃龍病菌PCR陽性病株空間分布格局與參數(shù)特征應(yīng)用研究

孟幼青，汪恩國，李艷敏，明 珂，袁亦文

(1.浙江省植物保護(hù)檢疫局，浙江 杭州310020； 2.臨海市農(nóng)技推廣中心，浙江 臨海317000； 3.臺州市植物保護(hù)檢疫站，浙江 椒江318000； 4.溫州市農(nóng)業(yè)局，浙江 溫州325000)

柑橘黃龍病(Huanglongbing，HLB)是由一種韌皮部桿菌屬(CandidatusLiberibacter spp.)細(xì)菌引起的，目前廣泛分布在亞洲、非洲、美洲等近50個國家和地區(qū)，對柑橘產(chǎn)業(yè)具有毀滅性危害，自然條件下主要通過攜帶病菌的柑橘木虱取食傳播，其癥狀表現(xiàn)較為復(fù)雜多樣[1-4]。田間目測調(diào)查常常產(chǎn)生誤診和漏診現(xiàn)象，同時由于柑橘植株從感病到顯癥具有較長潛伏期[4]，無法涉及田間潛伏隱癥病株，依“紅鼻果”測定柑橘黃龍病空間分布信息也常存較大誤差，PCR分子檢測可有效解決田間誤診和隱癥病株遺漏問題，目前應(yīng)用柑橘黃龍病菌PCR分子技術(shù)開展果園病株空間分布型和抽樣技術(shù)的研究尚屬鮮見[5-11]。為了更全面、更準(zhǔn)確地揭示浙江柑橘黃龍病陽性病株空間分布格局及其參數(shù)特征，建立柑橘黃龍病理論抽樣數(shù)模型和序貫抽樣模型，規(guī)范田間監(jiān)測預(yù)警與抽樣技術(shù)，筆者于2017—2018年對浙江7個柑橘黃龍病發(fā)生區(qū)的橘樹逐株采樣2 900個進(jìn)行黃龍病菌PCR檢測，系統(tǒng)調(diào)查研究柑橘黃龍病陽性病株空間分布格局與參數(shù)特征，旨在明確黃龍病陽性病株田間分布信息及其染病特征，探討病害發(fā)生與流行原因，為柑橘黃龍病監(jiān)測防控和相關(guān)試驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查采樣地概況

調(diào)查選自2000年浙江柑橘黃龍病入侵?jǐn)U散危害的發(fā)生區(qū)域，即位于浙東南沿海和浙西南的甌海、樂清、玉環(huán)、黃巖、寧海、慶元和蓮都等7個縣(市、區(qū))的樣地橘園，調(diào)查柑橘品種為甌柑、椪柑、溫州蜜柑、本地早、玉環(huán)柚、甜橘柚等，果園樹齡15～20年，種植密度675～1 200 株·hm-2，果園立地平原和山地，栽培常規(guī)管理，部分橘園失管。

1.2 調(diào)查采樣方法

2017年12月至2018年1月，根據(jù)調(diào)查縣(市、區(qū))柑橘種植情況和柑橘黃龍病發(fā)生情況，每縣(市、區(qū))選定柑橘果園面積33 hm2左右作為1個調(diào)查樣地，每樣地選擇4～5個連片果園，每果園調(diào)查100株，先逐株采用目測調(diào)查斑駁黃化、新梢均勻黃化、黃脈和缺素黃化等顯癥疑似病株[12]，然后1株采1樣，按樹冠東南西北中5方位采集當(dāng)年抽生的春梢葉片(有以上癥狀的則取其癥狀葉)各1張，5張組合為1樣，并依序進(jìn)行采樣編號，然后室內(nèi)測定柑橘黃龍病菌陽性或陰性。

1.3 黃龍病菌PCR檢測

委托浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，采用GBT28062—2011柑橘黃龍病菌實時熒光PCR檢測方法，對采集樣品進(jìn)行柑橘黃龍病菌攜帶情況檢測，記錄PCR檢測鑒定結(jié)果，然后依序按10株1樣方，統(tǒng)計田間陽性病株發(fā)生頻次。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黃龍病PCR陽性密度頻次分布

2.2 柑橘黃龍病PCR陽性病株空間分布型

2.2.1 聚集度指標(biāo)測定

應(yīng)用聚集度指標(biāo)測定結(jié)果顯示，被測7個橘區(qū)(橘園)樣地的黃龍病PCR陽性病株空間分布均達(dá)到C>1、I>0、K>0、CA>0、M*/m>1，均為聚集分布格局(表2)。表明柑橘黃龍病陽性病株的空間分布型為聚集分布格局，其聚集強(qiáng)度隨陽性病株密度升高而增強(qiáng)。

2.2.2 Iwao法檢驗

表1柑橘黃龍病PCR陽性病株密度及其頻次分布表

Table1Density and frequency distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

樣地序號(橘區(qū))Sample SerialNumber(Affected area)抽樣檢測樣方數(shù)Quadratenumber柑橘黃龍病PCR陽性病株頻次分布統(tǒng)計數(shù)量Statistical frequency distribution of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants012345678910陽性數(shù)量Number ofpositiveplants陽性率Positiverate/%陽性密度均值A(chǔ)veragepositivedensity(x)1(甌海 Ouhai)402533321011015614.001.40002(樂清 Yueqing)401873221120229022.502.25003(玉環(huán) Yuhuan)401665523111007518.751.87504(黃巖 Huangyan)501637920210007114.201.42005(寧海 Ninghai)4037201000000051.250.12506(慶元 Qingyuan)40333400000000112.750.27507(蓮都 Liandu)40315112000000184.500.4500

表2柑橘黃龍病PCR陽性病株分布聚集度指標(biāo)測定

Table2Determination of distribution index of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

樣地序號(橘區(qū))Sample serialnumber(Producingarea)樣方數(shù)QuadrateNumber平均數(shù)Average(x)方差Variance(V)擴(kuò)散系數(shù)Diffusioncoefficient(C)叢生指數(shù)Clumpingindex(I)KCA擁擠度Degree ofcongestion(M?)M?/m分布格局Distributionpattern1(甌海Ouhai)401.40005.8400 4.1714 3.1714 0.4414 2.2653 4.5714 3.2653 聚集Aggregated2(樂清Yueqing)402.25009.6875 4.3056 3.3056 0.6807 1.4691 5.5556 2.4691 聚集Aggregated3(玉環(huán)Yuhuan)401.87504.6594 2.4850 1.4850 1.2626 0.7920 3.3600 1.7920 聚集Aggregated4(黃巖Huangyan)501.42003.2836 2.3124 1.3124 1.0820 0.9242 2.7324 1.9242 聚集Aggregated5(寧海Ninghai)400.12500.2594 2.0750 1.0750 0.1163 8.6000 1.2000 9.6000 聚集Aggregated6(慶元Qingyuan)400.27500.3994 1.4523 0.4523 0.6080 1.6446 0.7273 2.6446 聚集Aggregated7(蓮都Liandu)400.45001.0475 2.3278 1.3278 0.3389 2.9506 1.7778 3.9506 聚集Aggregated

得α=0.697 6，即α﹥0，表明柑橘黃龍病陽性病株田間分布的基本成分是個體群，陽性病株個體間相互吸引，陽性病株在橘區(qū)(橘園)中存在明顯的發(fā)病中心；且β=1.929 6，即β>1，表明陽性病株個體群在橘區(qū)(橘園)中呈聚集分布格局，即分布的基本成分個體群之間趨于聚集分布特征，個體群內(nèi)個體與核心分布相吻合。

2.2.3 Taylor法檢驗

2.2.4 聚集原因分析

2.3 抽樣技術(shù)

2.3.1 最適抽樣模型

表3柑橘黃龍病PCR陽性病株聚集均數(shù)表

Table3Aggregation mean of Citrus Huanglongbing PCR-positive plants

序號No.x2kr(χ2)λ11.42002.165.63723.699122.25001.364.07796.739930.45000.682.60351.728540.12500.230.89330.480151.40000.883.39125.377460.27501.223.64280.823871.87502.536.57834.8844

圖1 柑橘黃龍病不同陽性率下所需最適抽樣數(shù)圖Fig.1 Optimum sampling number for different positive rates of Citrus Huanglongbing

當(dāng)橘區(qū)(橘園)黃龍病陽性率5%時，所需允許誤差D=0.2的抽樣數(shù)212株或允許誤差D=0.3的抽樣數(shù)94株；當(dāng)橘區(qū)(橘園)陽性率10%時，所需抽樣數(shù)D=0.2為129株或D=0.3為57株；當(dāng)橘區(qū)(橘園)陽性率20%時，所需抽樣數(shù)D=0.2為87株或D=0.3為39株；當(dāng)橘區(qū)(橘園)陽性率30%～50%時，所需抽樣數(shù)D=0.2為62～73株或D=0.3為28～33株。隨著黃龍病陽性病株率的上升，所需抽樣數(shù)遞減。

2.3.2 序貫抽樣

表4柑橘黃龍病PCR陽性檢測序貫抽樣表

Table4Sequential sampling table for PCR positive detection of Citrus Huanglongbing

nD0=0.15D0=0.20D0=0.2530-1885440-101435043479396024269367018464348015660339013957331001295532200954829

2.4 柑橘黃龍病目測診斷與PCR測定病株關(guān)系分析

經(jīng)對上述7個樣地果園柑橘黃龍病目測調(diào)查病株(E)與PCR陽性病株(Q)關(guān)系測定(表5、圖2)，總體柑橘黃龍病陽性發(fā)病率14.19%，其中陽性病株隱癥率1.10%，表明田間柑橘黃龍病的確診易受病株隱癥和目測誤診等干擾影響，目測視癥診斷常存病株隱癥漏診情況，且突出表現(xiàn)存在多診誤判現(xiàn)象，通過人為目測診斷與實驗PCR測定比較，顯示目測診斷病株總體隱癥漏診率7.75%，病株總體累加多診率47.11%，究其多診原因主要在于目測視診以斑駁黃化、缺素黃化、新梢均勻黃化、黃脈等顯癥癥狀進(jìn)行診斷，本次調(diào)查3 002株植株目測視癥診斷病株743株，其中斑駁黃化癥狀23.15%、缺素黃化癥狀59.26%、新梢均勻黃化和黃脈等其他癥狀17.59%，由于黃龍病缺素黃化癥狀與栽培生理缺素較易混淆，也易造成誤診。但是，目測診斷病株(率)與實驗PCR檢測陽性病株(率)兩者存在極顯著的線性關(guān)系，其數(shù)學(xué)模型為E=1.066 2Q+9.626 4(df=30，r=0.835 8**，r0.01=0.462 9)，依此模型分析目測診斷準(zhǔn)確率整體隨田間發(fā)病率升高而提高，一般田間病株陽性率10%時人為目測診斷準(zhǔn)確率僅為PCR陽性檢測的50%左右；當(dāng)田間病株陽性率20%時人為目測診斷準(zhǔn)確率可為PCR陽性檢測的65%左右；當(dāng)田間病株陽性率30%時人為目測診斷準(zhǔn)確率可為PCR陽性檢測的72%左右；當(dāng)田間病株陽性率50%以上時人為目測診斷準(zhǔn)確率可達(dá)PCR陽性檢測的80%以上。

表5柑橘黃龍病目測診斷病株與PCR檢測陽性病株關(guān)系表

Table5Relationship between visual diagnosis of Citrus Huanglongbing and PCR-positive strains

樣地序號(橘區(qū))Serialnumber果園編號Orchardnumber果園地址Orchardaddress品種Variety樹齡Woodage立地條件Siteconditions調(diào)查株數(shù)Numberof treesinvestigated視癥診斷病株Visualdiagnoseddiseased plantsPCR陽性病株P(guān)CR-positveplants疑癥病株Hypochon-driacplants隱癥病株Cryptopathicplants甌海Ouhai1三垟鎮(zhèn)應(yīng)潭村Yingtan Village,Sanyang Town甌柑Citrus suavissima Hort. ex Tanaka5平地Flatground100710—32三垟鎮(zhèn)應(yīng)潭村Yingtan Village,Sanyang Town甌柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka5平地Flatground100505—3麗岙鄉(xiāng)曹建村Caojian Village,Liao Township甌柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka10平地Flatground10048435—4澤雅鎮(zhèn)澤雅庫區(qū)Zeyaku District,Zeya Town甌柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka血橙Citrus sinensis Osbeckforma sanguinea15山地Mountainousarea10003—3樂清Yueqing5清江鎮(zhèn)江沿村Jiangyan Village,Qingjiang Town甌柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka5山地Mountainousarea1021126—15柚Citrus grandis(L.)Osbeck6清江鎮(zhèn)上埠頭村Shangbutou Village,Qingjiang Town甌柑Citrus suavissimaHort. ex Tanaka10平地Flatground1001789—早橘Citrus compressaTanaka

續(xù)表5

續(xù)表5

圖2 柑橘黃龍病人為目測診斷較PCR陽性檢測準(zhǔn)確程度表Fig.2 Comparison of accuracy of visual diagnosis and PCR-positive detection for Citrus Huanglongbing

3 討論

田間采樣檢測結(jié)果和檢驗分析表明，柑橘黃龍病陽性病株空間分布型為聚集分布，其分布的基本成分為個體群，個體間相互吸引，個體群之間趨于聚集分布特征，并且具有密度依賴性，陽性病株密度越高越趨向聚集分布，聚集強(qiáng)度隨陽性率上升而增強(qiáng)。究其聚集原因，在于當(dāng)樣方陽性病株密度在0.616 9(陽性率6.17%)以下時，λ<2，聚集是某些如氣候條件、栽培管理、病蟲防治等影響所致；當(dāng)樣方陽性病株密度在0.616 9(陽性率6.17%)以上時，λ≥2，其聚集是病害本身聚集特性行為與環(huán)境條件等綜合影響的結(jié)果。當(dāng)前柑橘黃龍病發(fā)病流行逐年呈加重趨勢，主要原因在于粗放管理果園面積增大，病菌病源擴(kuò)散，介體木虱種群數(shù)量多、帶菌率高、傳染機(jī)率上升，以及氣候條件如冬季氣溫上升促進(jìn)等影響所致。

由于柑橘黃龍病顯癥癥狀多樣復(fù)雜，本研究所采集的樣本癥狀有斑駁黃化(23.15%)、缺素黃化(59.26%)、新梢均勻黃化和黃脈等(17.59%)顯癥疑似病株，總體上除斑駁黃化與黃龍病的相關(guān)性較高外，其他類型的癥狀均易產(chǎn)生一定的錯誤率，視癥目測診斷難度較大，因此采集黃龍病相關(guān)性較高的樣本理論上應(yīng)該會有較高的檢測準(zhǔn)確率。通過視癥目測診斷(E)與PCR測定(Q)病株比較，兩者存在極顯著的線性關(guān)系，其關(guān)系模型為E=1.066 2Q+9.626 4(r=0.835 8**)，由此可見，為了提高病害診斷準(zhǔn)確率和田間調(diào)查效率，總體應(yīng)采取實驗檢測和視癥目測相結(jié)合，若田間黃龍病發(fā)病率為20%以下，則應(yīng)采取PCR檢測診斷調(diào)查；若田間黃龍病發(fā)病率為30%以上，則可采用視癥目測調(diào)查。若采用視癥目測診斷，一般需在陽性抽樣數(shù)量基礎(chǔ)上增加15%～30%，即可較準(zhǔn)確反映陽性病株抽樣數(shù)量和田間發(fā)生情況，這對田間取樣監(jiān)測預(yù)警和決策防治具有良好的指導(dǎo)意義。