雌激素對人子宮內膜樣癌Ishikawa細胞增殖、形態(tài)結構的影響及可能的作用機制

劉俊江，周正平，袁 丹，劉蒙蒙

(1.遵義醫(yī)科大學 病理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 電鏡室，貴州 遵義 563099)

子宮內膜癌(Endometrial carcinoma)是來源于子宮內膜上皮細胞的惡性腫瘤。在美國，它是發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，對女性健康造成了嚴重的威脅[1]。根據(jù)流行病學特征及臨床特點，子宮內膜癌可分為兩種類型，其中，I型為雌激素依賴型(占比約80%)，子宮內膜樣癌(endometrioid carcinoma,EC)是其主要的組織學類型。II型為非雌激素依賴型(占比約20%)，以漿液性癌為主[2]。研究表明，EC發(fā)病除與長期處于無孕激素的高水平雌激素(estrogen，E)環(huán)境密切相關外，還可能與細胞周期調控紊亂、多種癌基因的激活或抑癌基因的失活等因素相關[3]。p57kip2作為CKIs中CIP/KIP家族一員，可調節(jié)Cyclin蛋白和CDK，控制DNA復制，負向調控細胞周期。而Cyclin E作為Cyclin家族的一員，主要通過與CDK2結合，正向調節(jié)G1/S期的轉換，加快細胞周期進程[4-5]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2在子宮內膜癌中的表達不同于其它惡性腫瘤，推測女性激素可能參與調控p57kip2在子宮內膜癌中的表達。Cyclin E蛋白的異常增高可能是子宮內膜癌發(fā)生的早期事件，且參與了子宮內膜癌進展[6-7]。但在E干預下人子宮內膜樣癌Ishikawa細胞中p57kip2及Cyclin E的表達情況，目前國內外罕見報道。本實驗擬選用人高分化EC Ishikawa細胞，予低、中、高3種不同濃度(10-4、10-2、1μmol/L)雌二醇(β-Estradiol,E2)干預，進一步探討E調控、細胞周期調控對EC發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人高分化EC Ishikawa細胞購自南京凱基公司。

1.2 儀器與試劑 倒置顯微鏡(CKX41SF)為日本OLYMPUS公司產品；透射電子顯微鏡(H-7650)為日本日立公司產品；WB及RT-PCR相關儀器為美國BIO-RAD公司產品；酶標儀為美國Thermo Fisher公司產品。MTT粉末購自北京Solarbio公司；鼠抗人Cyclin E單克隆抗體購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司；鼠抗人p57kip2單克隆抗體購自英國Abcam公司；異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠IgG(二抗)、鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自碧云天生物技術(上海)研究所；E2為北京華邁科生物技術公司產品；RT-PCR相關試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 Ishikawa細胞體外培養(yǎng)及藥物分組 Ishikawa細胞置于含有10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。實驗組：濃度分別為10-4、10-2、1 μmol/L E2干預；對照組：不含E2的等體積完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)的24、48、72和96 h時進行MTT實驗，于培養(yǎng)的24、48和72 h時進行光鏡、電鏡、WB實驗，于培養(yǎng)的24和72 h時進行RT-PCR實驗。以下所有實驗重復次數(shù)均≥3次。

1.3.2 MTT法檢測Ishikawa細胞的增殖情況 對數(shù)生長期的Ishikawa細胞以1×105/L的濃度接種于96孔板中，待細胞貼壁生長后加入藥物處理一定時間(實驗分組及培養(yǎng)時間同1.3.1節(jié))，去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入20 μL/孔MTT溶液(避光操作)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕吸去上清，再加入100 μL/孔二甲基亞砜(DMSO)，持續(xù)震蕩10 min，用酶標儀測定波長為490 nm的吸光光度值(OD值)。細胞OD值=所測得OD值-空白組OD值。

1.3.3 倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況 對數(shù)生長期的Ishikawa細胞接種于6孔板中，水平、輕輕搖動培養(yǎng)液，盡量使細胞分布均勻。待細胞貼壁生長后加入藥物處理一定時間(實驗分組及培養(yǎng)時間同1.3.1節(jié))，于光學顯微鏡下觀察細胞生長密度及形態(tài)變化。

1.3.4 透射電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化 對數(shù)生長期的Ishikawa細胞傳代于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁生長，加入藥物處理一定時間后(實驗分組及培養(yǎng)時間同1.3.1節(jié))，胰蛋白酶消化、離心成細胞團塊，放入2.5%戊二醛固定，經樣品制備、超薄切片、醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重電子染色，最后在H-7650透射電鏡下觀察細胞超微結構改變。

1.3.5 RT-RCR法測定p57kip2和Cyclin E mRNA表達情況 對數(shù)生長期的Ishikawa細胞傳代于6孔板中，待細胞貼壁生長后加入藥物處理一定時間(實驗分組及培養(yǎng)時間同1.3.1)，去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入1mL/孔的RNAiso Plus液裂解細胞，提取總RNA，測定RNA濃度及純度(純度要求在1.8～2.0)，根據(jù)制造商逆法轉錄試劑盒說明，將RNA反轉錄為cDNA(反轉錄參數(shù)：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，4 ℃ forever)，調節(jié)cDNA終濃度為10 ng/μL，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明加入SYBR及對應引物(引物序列見表1)，進行實時PCR反應(循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5s、60 ℃ 30 s，共40次)。實驗結果計算用ΔΔCt方法進行相對定量。

表1引物序列表

基因名稱引物序列(5'—3')Cyclin EP57β-actin上游:GAG GCG TGC GTT TGC TTT TA下游:GGT GTC TGG AGG TGG CTG GT上游:CGG CGA TCA AGA AGA TGT C下游:GCT CTT TGG GCT CTA AAT TG上游:CCT GGC ACC CAG CAC AAT下游:GGG CCG GAC TCG TCA TAC

1.3.6 蛋白質印跡法檢測p57kip2和Cyclin E蛋白的表達情況 對數(shù)生長期的Ishikawa細胞傳代于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁生長后加入藥物處理一定時間(實驗分組及培養(yǎng)時間同1.3.1節(jié))。加入200 μL/瓶現(xiàn)配置的RIPA裂解液置于冰上(輕輕晃動培養(yǎng)瓶，利于充分裂解細胞)，30 min后超速離心得總蛋白，并測定蛋白濃度；按照制造商配膠說明配置分離膠及濃縮膠，通過SDS-PAGE電泳分離總蛋白(分離Cyclin E、β-actin時分離膠和濃縮膠濃度分別為10%、5%，分離p57kip2時分離膠和濃縮膠濃度分別為8%、5%)，切下目的蛋白所在區(qū)域的凝膠，并轉移到醋酸纖維素膜(PVDF膜)上后，將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，2 h后加入一抗稀釋液(p57kip2、β-actin、 Cyclin E鼠抗人單克隆抗體稀釋比例分別為1∶200、1∶1 000、1∶200)，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入熒光二抗稀釋液(稀釋比例為1∶10 000)反應2 h(室溫、避光)，再次洗膜，最后用Odyssey系統(tǒng)將PVDF膜掃描成像，并測出條帶OD值。目的蛋白OD值與內參蛋白OD值的比值即為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 MTT法檢測不同濃度E2作用于Ishikawa細胞后的生長曲線 隨E2作用時間的延長，對照組及各實驗組Ishikawa細胞均逐漸增長，其中，除10-2μmol/L組的24 h與96 h比較無差異外，各實驗組在各時間段之間比較均有差異(P<0.05)。隨E2作用濃度的增加，與對照組比較，1 μmol/L組增殖能力減弱，余實驗組的細胞增殖能力則有所增強，其中，除48 h 10-2μmol/L與1 μmol/L組比較及72 h對照組與10-4μmol/L組比較無差異外，余各組之間比較均有差異(P<0.05，見圖1)。

圖1 不同濃度E2作用于Ishikawa細胞后生長曲線

2.2 不同濃度E2作用于Ishikawa細胞72 h后細胞的形態(tài)改變

2.2.1 倒置顯微鏡 光學(倒置)顯微鏡下觀察結果顯示，對照組細胞(見圖 2A)形態(tài)以多邊形、梭形為主，伸展良好，呈上皮樣細胞表現(xiàn)，可見部分變亮、縮小、漂浮的死亡細胞。各組細胞間形態(tài)無明顯改變；1 μmol/L組密度變化不大(見圖2D)，余實驗組細胞密度不同程度增加(見圖2B、C)，其中，以10-2μmol/L組細胞密度增加更明顯(見圖2C)。

A：對照組； B： 10-4μmol/L組； C：10-2μmol/L組； D:1μmol/L組。圖2 不同濃度E2作用于Ishikawa細胞72 h后的生長情況 (×100 )

2.2.2 透射電鏡 對照組細胞(見圖3A)呈類圓形、形態(tài)規(guī)則，細胞表面可見較豐富的微絨毛，細胞內可見線粒體、溶酶體及內質網(wǎng)等細胞器，細胞核較大、不規(guī)則，偶見核分裂及自噬現(xiàn)象。與對照組相比，各實驗組細胞內線粒體及內質網(wǎng)有不同程度腫脹(見圖3B、C、D)，其中，以1 μmol/L組最明顯(見圖3D)。

A：對照組；B： 10-4μmol/L組；C： 10-2μmol/L組；D： 1 μmol/L組(A:Bar =2.0 μm,B、C、D:Bar=5.0 μm；↑：自噬，◆：內質網(wǎng)腫脹，★：線粒體腫脹。圖3 不同濃度E2作用于Ishikawa細胞72 h的形態(tài)情況

2.3 RT-RCR 法檢測不同濃度E2作用于Ishikawa細胞后p57kip2、Cyclin E mRNA的表達情況(見表2)。

2.3.1 p57kip2mRNA表達情況 不同濃度下：p57kip2mRNA在1μmol/L組表達最高、在10-2μmol/L組表達最低；其中，僅各時間段的10-2μmol/L組分別與對照組、10-4μmol/L組比較，1 μmol/L組分別與10-4、10-2μmol/L組比較，以及72 h時1 μmol/L組與對照組比較有差異(P<0.05)。隨作用時間延長：p57kip2mRNA在1 μmol/L組表達增加，在余實驗組表達則降低；但僅1 μmol/L組在24 h與72 h之間比較有差異(P<0.05)。

2.3.2 Cyclin E mRNA表達情況 不同濃度下：Cyclin E mRNA在1 μmol/L組表達最低、在10-2μmol/L組表達最佳；但僅在72 h時10-2、1 μmol/L組與對照組比較，10-4、10-2μmol/L組與1 μmol/L組比較有差異(P<0.05)。隨作用時間延長：Cyclin E mRNA在1 μmol/L組表達降低，而在余實驗組表達增加；但僅10-4、1 μmol/L組在24 h與72 h之間表達有差異(P<0.05)。

組別p57kip2Cyclin E24 h對照1.033 2±0.012 80.960 8±0.034 310-4μmol/L1.006 4±0.027 60.977 6±0.016 8☆10-2μmol/L0.892 9±0.012 2▼1.126 4±0.099 11 μmol/L1.074 3±0.035 5▲● 0.945 2±0.031 3□72 h對照1.046 6±0.027 70.890 5±0.016 0◇10-4μmol/L 0.948 2±0.083 81.219 1±0.035 410-2μmol/L 0.771 1±0.087 0◆1.242 5±0.025 21 μmol/L1.316 9±0.040 4■0.759 0±0.010 3○

▲與72 h 1 μmol/L組比較；▼與24 h對照組、10-4μmol/L組、1 μmol/L組比較；●與24 h 10-4μmol/L組、10-2μmol/L組比較；◆與72 h對照組、10-4μmol/L組、1 μmol/L組比較；■與72 h對照組、10-4μmol/L組比較；☆與72 h 10-4μmol/L組比較；□與72 h 1 μmol/L組比較；◇與72 h各實驗組比較；○與72 h 10-4μmol/L組、10-2μmol/L組比較；P<0.05。

2.4 WB檢測不同濃度E2作用于Ishikawa細胞后p57kip2、Cyclin E蛋白的表達情況(見表3、圖4)。

2.4.1 p57kip2蛋白表達情況 不同濃度下：p57kip2蛋白在10-4μmol/L組中表達最低，24 h時，p57kip2蛋白在對照組表達最高(見圖 4A)，而在48、72 h，p57kip2蛋白在1 μmol/L組表達最高(圖 4B、C)；但僅在各時間段10-4μmol/L組與對照組、1 μmol/L組及10-2μmol/L與1 μmol/L組比較，24 h 10-2μmol/L組與對照組比較，48、72 h 1 μmol/L組與對照組比較、10-4μmol/L組與10-2μmol/L組比較有差異(P<0.05)。隨作用時間延長：各實驗組p57kip2蛋白水平均逐漸增加；但僅對照組、10-4μmol/L組在24 h與72 h、48 h與72 h之間比較，10-2、1 μmol/L組在24 h與48、72 h之間比較有差異(P<0.05)。

2.4.2 Cyclin E蛋白表達情況 不同濃度下：Cyclin E蛋白表達在10-2μmol/L組表達最高，24 h時，Cyclin E蛋白在10-4μmol/L組表達最低，而在48、72 h，Cyclin E蛋白在1 μmol/L組表達最低；但僅在各時間段10-4、10-2μmol/L組與對照組比較，24、72 h時1 μmol/L組與對照組比較，48、72 h時10-2μmol/L、1 μmol/L組與10-4μmol/L組比較，10-2μmol/L組與1 μmol/L組比較有差異(P<0.05)。隨作用時間延長：Cyclin E蛋白在1 μmol/L組表達逐漸降低，而在余實驗組表達則逐漸增加；但僅10-2μmol/L、1 μmol/L組在24 h與48、72 h之間表達有差異(P<0.5)。

組別p57kip2Cyclin E24 h對照0.285 5±0.002 6△0.402 0±0.010 9▲10-4μmol/L0.251 0±0.002 20.421 4±0.007 310-2μmol/L0.253 2±0.004 0○0.433 5±0.005 9▼1 μmol/L0.284 0±0.007 2▽◇0.426 3±0.006 3?48 h對照0.284 4±0.007 80.401 2±0.006 410-4μmol/L0.257 1±0.002 5☆0.426 6±0.005 7●10-2μmol/L0.284 9±0.013 80.463 0±0.003 7★1 μmol/L0.329 9±0.008 3□0.389 9±0.009 672 h對照0.310 1±0.006 5※0.414 0±0.003 8■10-4μmol/L0.275 1±0.006 7¤0.431 3±0.010 2◆10-2μmol/L0.299 2±0.002 20.475 0±0.004 31 μmol/L0.335 1±0.007 4◎0.384 1±0.003 9

※與24、48h對照組比較；¤與24、48 h 10-4μmol/L組比較；○與48、72h 10-2μmol/L組比較；▽與48、72 h 1 μmol/L組比較，△與24 h 10-4、10-2μmol/L組比較；◇與24 h10-4、10-2μmol/L比較；☆與48 h對照組、10-2μmol/L組比較；□與48 h對照組、10-4、10-2μmol/L組比較；與72 h對照組、10-2μmol/L組比較；◎與72 h對照組、10-4、10-2μmol/L組比較；▼與48、72 h 10-2μmol/L組比較；?與48、72 h 1 μmol/L組比較；▲與24 h各實驗組比較；●與48 h對照組、10-2、1 μmol/L組比較；★與48 h對照組、1 μmol/L組比較；■與72 h各實驗組比較；◆與72 h 10-2、1 μmol/L組比較；與72 h 1 μmol/L組比較；P<0.05。

A：24 h；B：48 h；C：72 h；0：對照組;1 ：10-4μmol/L組;2：10-2μmol/L組;3 ：1 μmol/L組。圖4 不同濃度E2作用不同時間段p57kip2、Cyclin E 蛋白在Ishikawa細胞中表達情況

3 討論

目前研究認為，在缺少孕激素環(huán)境的E長期作用下，子宮內膜可出現(xiàn)失控性增殖，甚至發(fā)展為惡性腫瘤。E與E受體(estrogen receptor，ER)結合后，使得受體二聚化，并結合位于靶基因啟動子或其附近的E應答元件，從而誘導靶基因表達，促進細胞增殖[8]。Kong等[9]研究顯示，E2(10-8M、10-10M)能夠上調子宮內膜癌細胞(Ishikawa、HEC-1-B)中MTA-1mRNA的表達，促進細胞增殖。另有研究顯示，短期內大劑量應用E可使絕經后E依賴性腫瘤患者病情減輕[10]。Coelingh等[11]通過回顧E在乳腺癌治療中的應用發(fā)現(xiàn)，高劑量雌激素既可作為絕經后乳腺癌晚期患者的一線治療，也可用于ER拮抗劑、芳香化酶抑制劑等內分泌治療出現(xiàn)耐藥后的治療。

本實驗結果顯示：10-4、10-2μmol/L組對Ishikawa細胞的增殖具有促進作用，細胞密度也有不同程度增加，而1 μmol/L組對Ishikawa細胞增殖具有抑制作用，細胞密度無明顯改變；各實驗組細胞內線粒體、內質網(wǎng)有不同程度腫脹(以1μmol/L組最明顯)。提示：在Ishikawa細胞中，較低濃度E可誘導細胞增殖，而當E濃度較高時，則表現(xiàn)為抑制細胞增殖，還可使細胞明顯損傷。本實驗結果中10-4、10-2μmol/L組研究結果同Kong等[9]研究結果一致，但在1μmol/L組中表現(xiàn)出抑制細胞增殖的作用，同徐叢劍[10]研究結果一致。推測原因可能為較高濃度的E2快速耗竭了細胞中的ER，故E2不再具有促細胞增殖的能力，而其毒理作用可明顯損傷細胞，達到阻礙腫瘤進展的作用。

p57kip2發(fā)現(xiàn)時間晚于p27kip1及p21cip1，其基因定位于人染色體11p15.5，編碼的蛋白質相對分子量為57kDa，由316個氨基酸構成。p57kip2蛋白的N末端與cyclin-CDK結合后，改變了CDK分子活性位點的空間位置，使CDK激酶活性受到抑制，細胞無法越過G1期，從而阻礙細胞周期進程[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在許多人類惡性腫瘤(如前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等)組織中，p57kip2表達減少甚至缺如，表明低表達的p57kip2可能增加了惡性腫瘤發(fā)展的風險。在肝細胞癌中，當p57kip2下調時，體內或體外肝細胞癌的生長速度加快，侵襲能力增強[14]。Sun等[15]通過RT-PCR法和WB法研究發(fā)現(xiàn)，敲低肺癌相關轉錄物1(LUCAT1)后，p57kip2的表達水平上調，肺癌A549和SPC-A1細胞系的增殖受到抑制。夏望仙[16]研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2的表達在EIN組織中最高，其次為子宮內膜癌，在子宮內膜增生性病變中則為最低。這同本課題組前期研究結果并不完全一致[6]，推測可能與納入標本類型及數(shù)量不同有關。但均提示p57kip在子宮內膜癌中的表達不同于其他惡性腫瘤組織，推測女性激素可能參與調控p57kip2在子宮內膜癌中的表達。本實驗結果表明：隨著E2濃度增加、干預時間延長，p57kip2蛋白表達逐漸增加，p57kip2mRNA在10-4、10-2μmol/L組表達降低，在1 μmol/L組表達增加，其中，在1 μmol/L組表達最高、在10-2μmol/L組表達最低。提示：當E濃度較高時，可增加細胞中p57kip2的表達，使阻礙細胞周期進展的作用增強。說明較高濃度E不僅可導致Ishikawa細胞損傷，還可改變細胞中p57kip2表達，通過阻礙細胞周期進展，從而使腫瘤進展受到影響。而當E濃度較低時，則表現(xiàn)為下調Ishikawa細胞中p57kip2的表達，使阻礙細胞通過G1期的作用減弱。本實驗結果中，p57kip2mRNA表達與蛋白表達趨勢并不完全一致，推測可能與轉錄修飾、轉錄延遲、翻譯丟失等有關，或者與mRNA、蛋白降解周期不一致有關。

細胞周期蛋白(Cyclins)和Cyclin依賴性激酶(CDK)在細胞周期進程中有重要作用。不同的Cyclins -CDK復合物可在不同的細胞周期階段發(fā)揮其正向調節(jié)的功能。其中，Cyclin E-CDK2通過磷酸化許多下游信號蛋白(如RB蛋白)，從而在G1/S轉換中起關鍵作用。也可通過促進中心粒重復和中心體分離來促進細胞增殖。此外，Cyclin E-CDK2還可通過磷酸化DNA解旋酶復合物亞基MCM3和MCM7參與DNA損傷檢查點控制。在多種人類惡性腫瘤(例如乳腺癌，肺癌和宮頸癌)中，Cyclin E異常過度表達，且與不良預后相關[17-19]。Lv等[20]通過蛋白質印跡法和細胞免疫化學法發(fā)現(xiàn)，卵巢癌(Ovarian cancer，OC)的惡性程度隨Cyclin E表達增加而增加。同時還發(fā)現(xiàn)，當Cyclin E表達水平降低時，子宮內膜癌患者生存率有所增加[21]。本課題組前期研究顯示Cyclin E蛋白的異常增高可能是子宮內膜癌發(fā)生的早期事件，且參與了子宮內膜癌進展[7]。本實驗結果表明：隨著E2濃度增加、作用時間延長，Cyclin EmRNA及蛋白在1 μmol/L組表達逐漸減少，在余實驗組表達則逐漸增加，其中，在10-2μmol/L組表達最高、在1 μmol/L組表達最低。提示：較低濃度E可上調Ishikawa細胞中Cyclin E表達，使促進細胞通過G1期的作用增強，細胞增殖能力得以增強；而較高濃度E則降低了細胞中Cyclin E的表達，使正向調控細胞周期的作用減弱。

綜上所述，在Ishikawa細胞中，較低濃度E可能通過減少細胞中p57kip2表達、增加Cyclin E表達，促使細胞通過G1期，從而增強了細胞增殖的能力；而較高濃度E則可能通過誘導細胞中p57kip2表達、下調Cyclin E表達，阻礙細胞通過G1期，減弱細胞增殖能力，同時，高濃度E可迅速耗竭細胞中ER，故E不再具有促細胞增殖能力，而其毒理作用還可明顯損傷細胞，達到阻礙腫瘤進展的目的。