吳茱萸次堿抗Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大作用以及對NO的影響

李世月，黃 波，周金鑫，黃 娟，石京山，蔣青松，吳 芹

(1.遵義醫(yī)科大學 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.重慶醫(yī)科大學 藥理學教研室暨重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

心肌肥厚是多種因素引起心肌組織超負荷代償反應的結果，與心血管病人心力衰竭和猝死的發(fā)生密切相關。在細胞水平，心肌肥厚表現(xiàn)為心肌細胞直徑增大、蛋白合成增加等，又稱為心肌細胞肥大，簡稱心肌肥大。心肌肥大的形成是一個復雜的病理過程，其藥物治療和作用機制一直是人們關注的熱點，但近年一直未有突破性進展。吳茱萸次堿(rutaecarpine，Rut)是從貴州省道地中藥材吳茱萸中提取的一種吲哚喹唑啉類生物堿。Rut可促進降鈣素基因相關肽釋放，改善缺氧和異丙腎上腺素誘導的心臟重構[1-3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Rut通過抑制MAPK/ERK信號傳導對壓力負荷型心肌肥厚的發(fā)生具有抑制作用[4]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是內(nèi)皮細胞分泌的舒張血管的重要活性物質(zhì)，其水平或活性下調(diào)也參與了心肌肥厚的形成[5]。Xu等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，Rut通過促進一氧化氮(nitric oxide,NO)生成，對大鼠頸動脈內(nèi)膜增生有抑制作用。那么，除了上述信號通路，NO是否也參與了Rut的抗心肌肥大作用？這是值得深入研究的問題。

本實驗擬采用乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng)，研究Rut對血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)誘導心肌細胞肥大的作用，并探討NO在其中的作用，以期為Rut的進一步研發(fā)應用提供基礎藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 Rut(純度為98%，南京澤郞科技有限公司，批號：20110934)；Ang Ⅱ(Anaspec公司)；胰蛋白酶(生工生物工程有限公司)；DMEM干粉(GIBCO公司)；標準胎牛血清(天津灝洋生物品科技有限公司)；RIPA裂解液、NO和一氧化氮合成酶(NO synthase,NOS)檢測試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；PCR引物由大連寶生物工程有限公司負責設計及合成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 動物 SD大鼠種鼠30只，清潔級，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。合格證書號SCXK(渝)2007-0009。飼養(yǎng)和實驗過程嚴格遵守遵義醫(yī)科大學實驗動物管理與倫理的有關準則。

1.1.3 儀器 IX73熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；5417R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Multiscan全波長酶標儀(美國Thermo公司)；Nanodrop微量分光光度計(美國Thermo公司)；實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)；4000B細胞圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細胞培養(yǎng)及分組 用胰蛋白酶消化法將1～3 d齡乳鼠心室肌消化成單細胞懸液，差速貼壁分離1.5 h，將未貼壁心肌細胞用含20%胎牛血清的DMEM懸浮，調(diào)不同細胞密度分別接種于6孔板(用于細胞直徑測量，總蛋白提取和檢測)或T25培養(yǎng)瓶內(nèi)(用于RNA提取及檢測)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。18～30 h后見細胞貼壁生長，48 h細胞出現(xiàn)自發(fā)搏動。培養(yǎng)初始48h加入5′-BrdU 0.1 mmol/L抑制非心肌細胞生長，然后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，至72 h換無血清培養(yǎng)液并加入相應藥物，繼續(xù)孵育48 h后用于檢測。分組如下：①空白組：等體積PBS液；② Ang Ⅱ 組：0.1 μmol/L；③④⑤ Ang Ⅱ + Rut(0.1、1.0、10 μmol/L)組。

1.2.2 心肌細胞直徑測量 取有心肌細胞生長的玻片，預冷D-Hank′s 液漂洗，4%多聚甲醛固定15 min，晾干，常規(guī)HE染色，用細胞圖像分析系統(tǒng)測量單個細胞最大直徑，每張玻片測5個視野，每個視野測10～15個細胞，取其平均值。每組重復4次。

1.2.3 心肌細胞總蛋白測定 將6孔板內(nèi)培養(yǎng)好的心肌細胞用PBS清洗3次后，置于冰上加入RIPA裂解液，充分攪動裂解5 min后轉至EP管中，超聲破碎3min，存放于-80 ℃。BCA法測定總蛋白含量，并根據(jù)接種細胞數(shù)目來計算心肌細胞的蛋白含量。每組重復4次。

1.2.4 NO含量和NOS活性檢測 取加藥孵育48 h后的無血清培養(yǎng)基100 μL，按照NO和NOS測定試劑盒說明書操作，測定NO含量和NOS活性。并根據(jù)試劑盒提供的方法計算NO含量和NOS活性，NO根據(jù)標準曲線計算含量，總NOS活力(kU/L)=(總NOS活力測定管A-空白管A)×26.1/0.383×1.5。

1.2.5 Real time RT- PCR檢測心肌細胞心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)以及內(nèi)皮型NOS (endothelial NOS,eNOS)的mRNA表達 各組細胞均以3×106/mL密度接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，Rut組加入Rut(0.1、1.0、10 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后，按照Trizol試劑盒說明書提取心肌細胞總RNA，測定濃度后按逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄為 cDNA 并稀釋，進行PCR擴增，擴增條件如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。以β-actin為管家基因，采用 2-ΔΔCt法計算ANF，eNOS mRNA的相對表達水平。

表1引物序列

名稱GenBank序列號引物系列 (5′-3′)擴增片段(bp)ANFNM 012612F-TGACAGGATTGGAGCCCAGAG75R-TCGAGCAGATTTGGCTGTTATCTTCeNOSNM 021838F-AGCTGGATGAAGCCGGTGAC164R-CCTCGTGGTAGCGTTGCTGAβ-actinNM 031144F-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA150R-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG

2 結果

2.1 Rut對Ang Ⅱ誘導心肌肥大的影響 細胞形態(tài)學檢測可見，加入Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)后，心肌細胞明顯增大(見圖1)，細胞直徑、總蛋白含量明顯增加，ANF mRNA表達增加(P<0.05)(見表2)，提示心肌細胞肥大。以平均值計算，Ang Ⅱ處理后，細胞直徑增加了約1.0倍，蛋白含量增加了19.1%，ANF mRNA表達增加2.8倍；與單獨給予Ang Ⅱ比較，Rut(0.1、1、10 μmol/L)劑量依賴的抑制Ang Ⅱ誘導的心肌細胞直徑增大和總蛋白含量的增加，其抑制率分別為5.1%、13.9%、26.0%(P<0.05)和11.7%、12.9%、14.9%(P<0.05)；且下調(diào)Ang Ⅱ誘導的ANF mRNA的表達，分別下調(diào)36.3%、43.6%和47.7%(P<0.05)。

A：空白組；B:AngⅡ(1.0 μmol/L)；C:AngⅡ+Rut(0.1 μmol/L)；D:AngⅡ+Rut(1.0 μmol/L)；E:AngⅡ+Rut(10 μmol/L)。圖1 吳茱萸次堿(Rut)對Ang Ⅱ誘導心肌細胞肥大的影響(×400)

組別心肌細胞直徑(μm)蛋白含量(pg)ANF mRNA空白52.4±5.6100.6±4.4100.0±6.1Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)106.6±8.8#119.8±0.7# 286.2±25.1#Rut(0.1 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)101.2±6.4105.8±1.1? 182.4±20.2?Rut (1 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)91.8±7.0?104.4±1.9?161.3±5.8?Rut(10 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)78.9±5.7?101.9±1.2?149.6±6.9?

#：與空白組比較，P<0.05；*：與Ang Ⅱ組比較，P< 0.05。

2.2 Rut對Ang Ⅱ誘導心肌肥大中NO含量和NOS活性的影響 加入Ang Ⅱ后，培養(yǎng)心肌細胞上清液中NO含量和NOS活性顯著降低，分別減少了72.7%和42.1% (P<0.01)；Rut明顯升高Ang Ⅱ所減少的NO含量和NOS活性水平(P<0.05)，結果見表3。

組別NO含量(μmol/L)NOS活性(kU/L)空白4.62±0.364.01±0.54Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)1.26±0.51##2.32±0.24##Rut (0.1μmol/L)+Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)2.91±0.42?2.83±0.08Rut (1.0μmol/L)+Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)3.35±0.33?3.20±0.07?Rut (10 μmol/L)+Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)4.13±0.25?4.03±0.78?

##：與空白組比較，P<0.01；*：與Ang Ⅱ組比較，P<0.05。

2.3 Rut對Ang Ⅱ誘導的肥大心肌細胞中eNOS mRNA表達的影響 Real time RT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，Ang Ⅱ明顯降低eNOS mRNA的表達(P<0.05)。與Ang Ⅱ組比較，Rut中、高劑量組明顯升高eNOS mRNA表達(P<0.05)(見表4)。

組別eNOS mRNA空白146.12±29.36Ang(1.0 μmol/L)47.26±19.08#Rut(0.1μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)58.21±18.05Rut(1.0 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)82.30±21.11?Rut(10 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)125.63±26.07?

#：與空白組比較，P<0.05；*：與Ang Ⅱ組比較，P<0.05。

3 討論

心肌肥大是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素之一，目前抑制心肌肥厚的藥物主要有利尿藥、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和鈣拮抗劑等，但療效不夠理想，相關藥物的研發(fā)一直是心血管疾病防治領域的研究熱點和難點[7-8]。NO是血管內(nèi)皮合成的舒血管物質(zhì)，血管內(nèi)皮細胞釋放NO后，激活鳥苷酸環(huán)化酶，cGMP生成增加，血管舒張。當各種因素刺激或作用，NO生成減少或降解增加，血管平滑肌細胞中NO水平下降，血管舒張效應減弱，從而增強縮血管物質(zhì)的作用，血管長期處于收縮狀態(tài)，血壓升高，心臟后負荷增加，通過不同信號通路作用，最終導致心肌肥厚[9]。因此，促進NO含量升高的藥物具有保護心肌肥厚的作用。

Rut是傳統(tǒng)中藥吳茱萸的主要活性成分之一，具有利尿、抗血小板聚集、舒張血管、抑制環(huán)氧酶-2等多種生物活性[10-11]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，Rut抗血管平滑肌細胞增殖作用與其促進NO釋放有關[12]，但對于Rut心肌肥厚保護作用與NO之間的關系目前未見報道。本研究中，Ang Ⅱ作用48 h后，心肌細胞NO含量明顯減少，NOS活性明顯降低；同時，心肌細胞的直徑、蛋白質(zhì)含量、ANF mRNA表達及形態(tài)學改變均提示心肌細胞出現(xiàn)肥大的病理改變。這些結果提示，NO釋放減少參與了心肌肥大的形成發(fā)展過程。Rut抑制心肌肥大改變同時，使NO水平明顯增高，提示Rut具有抗心肌細胞肥大作用，該作用可能與其增加NO含量有關。由于Rut作用廣泛，其促進NO釋放作用可能涉及多種信號通路，故尚需進行深入研究。