蛹蟲(chóng)草高產(chǎn)蟲(chóng)草素復(fù)合誘變育種及固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化

孫翠， 王 鈺， 李闊闊， 陳達(dá)偉

(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 合肥 230601)

蛹蟲(chóng)草Codycepsmilitaris(L.) Link又名北冬蟲(chóng)夏草，是蟲(chóng)草屬真菌的模式菌種[1-2]，能夠產(chǎn)生蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、腺苷等次生代謝產(chǎn)物[3-4]。其中，蟲(chóng)草素是1950年Cunninghamk等人從蛹蟲(chóng)草的培養(yǎng)濾液中分離得到的，是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的核苷類(lèi)抗菌素[5]，具有抗腫瘤[6-7]、抗菌和提高免疫[8-9]等作用，近年來(lái)受到廣泛重視。但化學(xué)合成難度大，因此在市場(chǎng)上的蟲(chóng)草素價(jià)格很高。蟲(chóng)草素主要是從蛹蟲(chóng)草菌株得到的次生代謝產(chǎn)物，因具有與冬蟲(chóng)夏草藥理相似性被廣泛應(yīng)用[10]。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，很難滿(mǎn)足臨床使用[11]。

因此，如何提高蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素含量成為研究重點(diǎn)。Sari等[12]通過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選高產(chǎn)蟲(chóng)草素菌株，而誘變育種是提高菌種產(chǎn)量和性能的主要途徑，因其操作簡(jiǎn)單，正突變能力強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定性高[13]等優(yōu)點(diǎn)故被很多研究者所青睞。霍景波等[14]對(duì)蛹蟲(chóng)草誘變，選育1株高產(chǎn)菌株H4025；王亮等[15]利用超聲波和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理，將蛹蟲(chóng)草的蟲(chóng)草素產(chǎn)量分別提高了33.5%和103.5%。

本文以蟲(chóng)草素含量為指標(biāo)，采用60Coγ射線(xiàn)與紫外復(fù)合誘變的方式對(duì)蛹蟲(chóng)草進(jìn)行處理以此來(lái)提高蟲(chóng)草素的含量，并通過(guò)響應(yīng)面分析法研究固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中各工藝條件對(duì)蛹蟲(chóng)草生產(chǎn)蟲(chóng)草素的影響，最終得到固態(tài)發(fā)酵條件的最優(yōu)組合。并為獲得高產(chǎn)蟲(chóng)草素菌株提供參考方法和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：蛹蟲(chóng)草C-8，于4℃冰箱中保存。

1.1.2 試劑和儀器

蟲(chóng)草素標(biāo)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；高效液相色譜儀，Waters;60Coγ射線(xiàn)誘變?cè)O(shè)備，中科院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院提供；恒溫恒濕箱，寧波江南儀器廠; 水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠; SCQ-2201 超聲波清洗機(jī)，中國(guó)聲彥超生設(shè)備公司; 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：18R型，力康發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g)：馬鈴薯200、葡萄糖20、 KH2PO41，酵母粉2，MgSO41,瓊脂20，pH 6，蒸餾水定容至1 L。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g): 葡萄糖20，瓊脂20，KH2PO41，酵母粉2，MgSO41,馬鈴薯汁、大米作為基質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 蟲(chóng)草素測(cè)定[16]

液相色譜條件：色譜柱Agilent 5TC-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流速1.0 mL/min;梯度洗脫流動(dòng)相比例為純水∶甲醇(85∶15)進(jìn)樣量10 μL,柱溫保持在30℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：稱(chēng)取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品，流動(dòng)相溶解定容至100 mL,溶解于溶液中，配制成100 μg/mL溶液。分別吸取2、4、6、8及10 mL溶液于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為20、40、60、80和100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=8E+06x-40 646(R2=0.997)。其中R2=0.997，代表質(zhì)量濃度(mg/g);y代表峰面積。

提取方法：蛹蟲(chóng)草發(fā)酵米于60℃烘干至恒重，磨碎過(guò)100目篩。稱(chēng)取0.1 g于10 mL容量瓶中，加入10 mL蒸餾水超聲30 min，10 000 r/min離心5 min。取上清用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.2 誘變育種

1)蛹蟲(chóng)草60Coγ誘變。活化菌株C-8，培養(yǎng)至12 h,離心取菌體，生理鹽水溶解菌體并稀釋?zhuān)瑩u床震蕩1 h，使菌體完全分散，制成單孢子菌液，涂布在平板上，利用原子能放射儀分別以50、100、150和200 Gy的輻照劑量進(jìn)行誘變處理。然后涂平板，每組做3個(gè)重復(fù)，于25℃培養(yǎng)形成單菌落，計(jì)算致死率。

2)復(fù)合誘變。選取經(jīng)60Coγ誘變后蟲(chóng)草素達(dá)到最高的突變菌株作為出發(fā)菌株，制備菌懸液，打開(kāi)紫外燈(25W)約30 cm處，分別進(jìn)行照射20、40、60、80、100及120 s。取經(jīng)紫外誘變照射后的菌液涂布平板，每組做3個(gè)重復(fù)，于25℃培養(yǎng)形成單菌落，計(jì)算致死率。

3)計(jì)算誘變菌株的致死率。

致死率(%)=(對(duì)照菌落數(shù)-處理菌落數(shù))/對(duì)照菌落數(shù)×100%

(1)

正突變率(%)=(蟲(chóng)草素產(chǎn)量高于出發(fā)菌株數(shù)/誘變存活菌株數(shù)) ×100%

(2)

1.2.3 復(fù)合誘變篩選出菌株的蟲(chóng)草素產(chǎn)量

蛹蟲(chóng)草進(jìn)行60Coγ-UV復(fù)合誘變后的發(fā)酵菌絲體進(jìn)行60℃烘干，過(guò)100目篩后進(jìn)行蟲(chóng)草素含量檢測(cè)，篩選蟲(chóng)草素產(chǎn)量較高的菌株。

1.2.4 高產(chǎn)蟲(chóng)草素菌株篩選

以5%的量接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃條件下發(fā)酵28 d。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中蟲(chóng)草素含量。對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)并檢測(cè)連續(xù)傳代12次的蟲(chóng)草素產(chǎn)量，分析遺傳穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵篩選高產(chǎn)蟲(chóng)草素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變

2.1.160Coγ誘變劑量的確定

由圖1可知，蛹蟲(chóng)草菌株致死率隨著60Coγ輻射劑量的增加而提高，200 Gy時(shí)致死率達(dá)到98.3%。正突變率在輻射強(qiáng)度較低的情況下不斷地增大，100 Gy時(shí)達(dá)到最大，為19.1%，此時(shí)致死率為83.2%。而只有當(dāng)致死率在70%～80%時(shí)[17]所得到的菌株才是可以滿(mǎn)足篩選需求。因此采用60Coγ劑量為100 Gy進(jìn)行誘變處理。

圖1 60COγ輻射對(duì)菌株致死率及正突變率的影響

2.1.260Coγ射線(xiàn)復(fù)合紫外誘變劑量的確定

如圖2 所示，隨著紫外照射時(shí)間延長(zhǎng)致死率緩慢增加，120 s時(shí)，致死率達(dá)到95.3%。當(dāng)紫外線(xiàn)處理時(shí)間為80 s時(shí)，致死率為81.45%，正突變率達(dá)到最大值28.7%。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇80 s作為紫外誘變時(shí)間。

圖2 60COγ輻射復(fù)合紫外對(duì)菌株致死率及正突變率的影響

2.1.3 復(fù)合誘變篩選出菌株的蟲(chóng)草素產(chǎn)量

對(duì)蛹蟲(chóng)草進(jìn)行60Coγ-UV復(fù)合誘變，選擇60Coγ誘變劑量為100 Gy與紫外照射時(shí)間為80 s，對(duì)誘變后得到的31株突變株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)28 d后，采用HPLC法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的蟲(chóng)草素進(jìn)行定量檢測(cè)。得到C1-7蟲(chóng)草素的產(chǎn)量為7.376 mg/g,而相同發(fā)酵條件下出發(fā)菌株的蟲(chóng)草素產(chǎn)量?jī)H為4.12 mg/g(圖3)。

圖3 誘變菌株蟲(chóng)草素產(chǎn)量

圖4 誘變菌株C1-7遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.4C1-7遺傳穩(wěn)定性

將通過(guò)復(fù)合誘變篩選得到的菌株C1-7進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)至12代，檢測(cè)1、3、6、9及12代發(fā)酵產(chǎn)物中蟲(chóng)草素含量。發(fā)現(xiàn)傳至12代時(shí)，蟲(chóng)草素產(chǎn)量仍可達(dá)7.209 mg/g(圖4)。雖然相對(duì)于1代略有下降，但沒(méi)有顯著性差異，基本保持產(chǎn)量的穩(wěn)定性，說(shuō)明該誘變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 前期溫度對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

從圖5可以看出，蛹蟲(chóng)草菌絲培養(yǎng)前期適宜溫度為25℃，之后隨著溫度的增加，蟲(chóng)草素產(chǎn)量達(dá)到最高值后急劇下降，當(dāng)溫度增加至31℃時(shí)產(chǎn)量幾乎可以忽略，說(shuō)明此溫度范圍下蟲(chóng)草素菌絲體幾乎不生長(zhǎng)。

圖5 前期溫度對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

2.3 后期溫度對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

由圖6 可知，后期溫度為21℃時(shí)，蟲(chóng)草素含量達(dá)到最大為7.072 mg/g,之后隨著溫度的增加蟲(chóng)草素含量將不斷的下降，而當(dāng)后期溫度高于前期溫度25℃時(shí)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)緩慢幾乎不代謝蟲(chóng)草素。

圖6 后期溫度對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

2.4 初始含水量對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

從圖7可以看出，蟲(chóng)草素含量隨著初始含水量的增加先增大后減小。65%時(shí)，蟲(chóng)草素含量達(dá)到最高；以后隨著初始含水量的增大，蟲(chóng)草素含量反而降低。最終確定最佳初始含水量為65%。

2.5響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以前期溫度、后期溫度、初始含水量為試驗(yàn)因素，采用Box-Benhnken中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)組合的多因素試驗(yàn)。前期溫度、后期溫度以及初始含水量的水平編碼見(jiàn)表1。

圖7 初始含水量對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

水平因素A前期溫度(℃)B后期溫度(℃)C初始含水量(%)-123196002521651272370

采用Design Expert.8.0.6.1統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，二次回歸方程：

S=9.44-0.81A-0.77B-0.32C+0.65AB-0.30AC+0.15BC-1.42A2-3.13B2-1.09C2

(3)

式(3)中：S為蟲(chóng)草素含量；A為前期溫度(℃)；B為后期溫度(℃)；C為初始含水量(%)。

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。由表3可知，模型P=0.0005<0.01，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P=0.1317，P>0.05不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度較好，可用此模型進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。

由表3可知，對(duì)蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素影響的主次順序?yàn)楹笃跍囟?初始含水量>前期溫度，其中一次項(xiàng)后期溫度對(duì)蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素影響最為顯著。二次項(xiàng)前期和后期溫度及初始含水量；后期溫度和初始含水量的交互作用有顯著影響(P<0.01)。

表3 回歸模型方差分析

注：*為顯著(P<0.05);**為極顯著(P<0.01)

圖8顯示，前期溫度為25℃時(shí)、后期溫度和初始含水量對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響。隨著后期溫度和初始含水量的增加，蟲(chóng)草素產(chǎn)量也隨著增加。而當(dāng)后期溫度為21℃，初始含水量為65%時(shí)，蟲(chóng)草素的產(chǎn)量隨著因素的增加而逐漸下降，說(shuō)明后期溫度和初始含水量過(guò)高或過(guò)低時(shí)，均對(duì)蟲(chóng)草素的產(chǎn)量有影響。

圖8 前期溫度為25℃時(shí)后期溫度和初始含水量對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

利用回歸方程(3)預(yù)測(cè)蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為:前期溫度24.3℃、后期溫度20.6℃和初始含水量為63.8%。在此條件下，蟲(chóng)草素的產(chǎn)量為9.686 mg/g?？紤]實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用，最佳干燥條件應(yīng)修正為：前期溫度為24℃、后期溫度為21℃和初始含水量為64%。在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得蟲(chóng)草素含量為9.595 mg/g，與預(yù)測(cè)值絕對(duì)誤差值僅相差5%。說(shuō)明此模型合理可靠。

2.6 誘變菌株與出發(fā)菌株子實(shí)體參數(shù)的比較

由表4可知，其中C1-7鮮重達(dá)到55.74 g，比對(duì)照組超出75.78%，蟲(chóng)草素12.68 mg/g蟲(chóng)草素含量為12.68 mg/g比出發(fā)菌株提高了100.2%，干重為7.998 g，生物學(xué)效率為69.97，說(shuō)明誘變菌株具有較高的研究?jī)r(jià)值。

表4 子實(shí)體參數(shù)比較Table 4 Comparison of unit energy consumption

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用60Coγ結(jié)合UV對(duì)原始產(chǎn)蟲(chóng)草素菌株C-8進(jìn)行復(fù)合誘變得到菌株C1-7,結(jié)果表明C1-7菌株比出發(fā)菌株的蟲(chóng)草素提高了79%。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman方法對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳固態(tài)發(fā)酵的參數(shù)組合為：前期溫度為24℃、后期溫度為21℃、初始含水量為64%的條件下，誘變菌株C1-7中蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高至9.595 mg/g，比出發(fā)菌株C-8提高132.9%。將蛹蟲(chóng)草進(jìn)行栽培試驗(yàn)得到菌株C1-7子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量為12.68 mg/g比菌株C-8提高了100.2%。該試驗(yàn)通過(guò)復(fù)合誘變和培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高了產(chǎn)蟲(chóng)草素。但是對(duì)蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵目前還處于小試階段，還有待進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。