建立表達(dá)犬NECTIN4的牛源細(xì)胞株用于培養(yǎng)犬瘟熱病毒

楊思鳴, 蔡?hào)|焱, 孫曼曼, 陳 霄, 戴曉峰, 白仲虎

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122；3. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科， 無錫 214062)

犬瘟熱(Canine distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)感染引起的急性、高度接觸性傳染病，是當(dāng)前對(duì)我國養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害最大的疫病之一，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。近年來，陸續(xù)有不同種動(dòng)物發(fā)生CD的報(bào)道，尤其是國寶大熊貓和獼猴等珍稀野生動(dòng)物受犬瘟熱病毒感染致死事件的發(fā)生更是引起越來越多的學(xué)者對(duì)犬瘟熱病毒的關(guān)注和重視[2-3]。

犬瘟熱病毒感染細(xì)胞通過病毒囊膜上的H蛋白與被感染細(xì)胞表面特異性受體相結(jié)合，F(xiàn)蛋白介導(dǎo)膜融合使得病毒可以順利進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。因此細(xì)胞是否表達(dá)能和H蛋白結(jié)合的特異性受體是影響細(xì)胞敏感性的關(guān)鍵因素[4]。目前已發(fā)現(xiàn)犬瘟熱病毒有3種受體，分別為CD46(Complement-regulatory protein 46，CD46)[5-6]和黏附連接蛋白(Nectin cell adhesion molecule 4, NECTIN4)[7]，其中NECTIN4分子IgV結(jié)構(gòu)可與犬瘟熱病毒H蛋白形成所有犬瘟熱病毒受體中最強(qiáng)的結(jié)合力[8-9]。

本研究通過克隆犬瘟熱病毒受體NECTIN4序列，在MDBK細(xì)胞中表達(dá)并通過G418篩選獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，成功利用牛源細(xì)胞培養(yǎng)犬源病毒，為稀有病毒的分離培養(yǎng)提供新的途徑，為工業(yè)疫苗生產(chǎn)細(xì)胞株的開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株和細(xì)胞

載體pcDNA3.1(+)、克隆菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞系MDBK購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。犬瘟熱病毒購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。

1.1.2 主要試劑

高保真聚合酶PrimerStar、T4 DNA連接酶(TaKaRa)，限制性內(nèi)切酶(Thermo)，膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(TIANGEN)。

DMEM(Hyclone)、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco)、鮭魚精(Sigma)、G418(Biosharp)、RNA提取試劑盒(TIANGEN)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qRT-PCR試劑盒(TaKaRa)、蛋白裂解液RIPA、免疫熒光試劑盒(碧云天)、DAPI(BD)，抗Flag標(biāo)簽的兔多抗、抗GAPDH兔多抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Proteintech)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的犬瘟熱病毒單克隆抗體(VMRD)。

這份按照里帕的引用頻次，由保羅·托奇的整理的，長達(dá)四頁的“所引用的作家目錄”索引表，可謂是一個(gè)有用的指引，后人從中大致可以得出《圖像學(xué)》對(duì)古代作品的依賴程度的判斷。

1.2 方法

1.2.1 犬NECTIN4表達(dá)載體的構(gòu)建

參考GenBank上登錄的犬源NECTIN4 mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001313853.1)，在起始密碼子ATG 5′端添加酶切位點(diǎn)EcoR I和Kozak序列：GCCACC，編碼序列3′端添加Flag標(biāo)簽、終止密碼子TGA和酶切位點(diǎn)XbaI，蛋白編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后由上海捷瑞生物有限公司合成，酶切連接到載體pcDNA3.1(+)上，得到質(zhì)粒pcDNA-DogN4-Flag。

1.2.2 MDBK細(xì)胞轉(zhuǎn)染

胰酶消化細(xì)胞后使用預(yù)冷的PBS洗滌一遍，200 μL PBS重懸2×106個(gè)細(xì)胞，加入20 μg質(zhì)粒、10 μg鮭魚精后置于預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴1 min，使用細(xì)胞電穿孔儀350 V、500 μs電擊3次，每次間隔1 min。最后使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中。

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選

轉(zhuǎn)染后48 h添加抗生素G418，使終濃度為1400 μg/mL，抗生素篩選一周后使用有限稀釋法挑取單克隆，命名為MDBK-N4細(xì)胞。

1.2.4 RT-PCR檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中NECTIN4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

使用NCBI網(wǎng)站中Primer-blast功能設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄PCR引物并交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。本試驗(yàn)所用的引物見表1。

表1 本試驗(yàn)所用的引物

MDBK細(xì)胞(陰性對(duì)照)和MDBK-N4細(xì)胞接種于6孔板，長至80%～90%匯合度時(shí)，利用試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，取1 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR引物通過PCR擴(kuò)增NECTIN4和GAPDH。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并分析結(jié)果。

1.2.5 Western Blot檢測NECTIN4的表達(dá)

MDBK(陰性對(duì)照)和MDBK-N4細(xì)胞接種于6孔板，長至80%～90%匯合度時(shí)，使用裂解液RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白并定量。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并利用電轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜3次并使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，封閉后TBST洗膜3次使用一抗4℃孵育過夜，一抗孵育后加入TBST洗膜3次使用二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，BCL試劑顯色，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀觀察。

1.2.6 間接免疫熒光觀察NECTIN4和病毒外殼蛋白表達(dá)

NECTIN4樣品準(zhǔn)備。MDBK(陰性對(duì)照)和MDBK-N4細(xì)胞接種于96孔板，長至50%～60%匯合度時(shí)可用于觀察NECTIN4的表達(dá)，進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

病毒外殼蛋白樣品準(zhǔn)備。細(xì)胞長至70%～80%時(shí)，PBS洗滌1遍，接種50 μL犬瘟熱病毒，1 h病毒吸附完成后，換成2% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，便可用于間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

間接免疫熒光。樣品制備完成后，使用PBS洗滌3次(后面洗滌操作亦同)，加入固定液室溫固定10 min，洗滌后通透液室溫通透10 min，洗滌后加入含2% 脫脂奶粉的PBS封閉1 h，洗滌后加入一抗室溫孵育1 h，再次洗滌后二抗孵育1 h，再次洗滌后DAPI染色10 min，洗滌后使用倒置熒光顯微鏡觀察蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pCDNA-DogN4-Flag的鑒定

限制性內(nèi)切酶EcoR I和XbaI的雙酶切結(jié)果顯示(圖1)，泳道1中5400 bp的條帶為被兩酶切開的pcDNA-DogN4-Flag質(zhì)粒骨架，1570 bp的條帶為兩酶切位點(diǎn)間所連接的NECTIN4片段。

M: DL10000 DNA marker; 1: pcDNA-DogN4-Flag (digested withEcoR I andXbaI)

圖1質(zhì)粒pcDNA-DogN4-Flag的鑒定

Figure 1 Identification of recombinant pcDNA-DogN4-Flag

2.2 MDBK-N4細(xì)胞株的鑒定

2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測MDBK-N4細(xì)胞株中NECTIN4的表達(dá)

逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示(圖2)，以MDBK-N4細(xì)胞(第10代)的cDNA為模板進(jìn)行PCR，泳道2、4顯示NECTIN4和GAPDH均有表達(dá)，以MDBK細(xì)胞的cDNA為模板，泳道1、3顯示只有GAPDH表達(dá)。說明MDBK-N4細(xì)胞中NECTIN4在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有表達(dá)。

M: DL500 DNA marker; 1～2: MDBK cells and MDBK-N4 cells forNECTIN4; 3～4: MDBK cells and MDBK-N4 cells forGAPDH

圖2逆轉(zhuǎn)錄PCR分析MDBK-N4細(xì)胞系中NECTIN4 mRNA表達(dá)

Figure 2 The expression ofNECTIN4 mRNA detected in MDBK-N4 cells by using reverse transcriptional PCR

2.2.2 Western Blot檢測MDBK-N4細(xì)胞株中NECTIN4表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示(圖3)，相比對(duì)照組MDBK細(xì)胞，MDBK-N4細(xì)胞(第10代)在56 ku處有明顯條帶，說明MDBK-N4細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)NECTIN4蛋白。

2.2.3 免疫熒光檢測MDBK-N4細(xì)胞株中NECTIN4的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示(圖4)，相比對(duì)照組MDBK細(xì)胞(圖4-A)，MDBK-N4細(xì)胞(第10代，圖4-B)中NECTIN4(綠光)有表達(dá)，且主要分布在細(xì)胞膜周圍，圍繞細(xì)胞核(藍(lán)光)，說明MDBK-N4細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)NECTIN4，且蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜。

圖3 Western blot檢測MDBK-N4細(xì)胞NECTIN4蛋白的表達(dá)

A: MDBK cells; B: MDBK-N4 cells

圖4免疫熒光檢測MDBK-N4細(xì)胞中NECTIN4的表達(dá)(單細(xì)胞放大圖)

Figure 4 Expression of NECTIN4 detected in MDBK-N4 cells by fluorescent microscope (Enlarge for single cell)

2.3 免疫熒光檢測病毒感染后的MDBK-N4細(xì)胞

免疫熒光結(jié)果顯示(圖5)，受到犬瘟熱病毒感染3 d后，MDBK-N4細(xì)胞(第10代)產(chǎn)生了明顯病變現(xiàn)象，部分凋亡脫落，大部分細(xì)胞拉絲，病毒外殼蛋白(綠光)分布在細(xì)胞內(nèi)部，說明MDBK-N4細(xì)胞表達(dá)的NECTIN4發(fā)揮了病毒受體的功能，犬瘟熱病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖產(chǎn)生了子代病毒，隨后感染周圍細(xì)胞，引起大量細(xì)胞凋亡。

A: MDBK cells; B: MDBK-N4 cells

圖5免疫熒光檢測細(xì)胞中犬瘟熱病毒的蛋白外殼(×20)

Figure 5 Envelope protein of canine distemper virus detected in MDBK-N4 cells by fluorescent microscope (×20)

3 討論

NECTIN4是一個(gè)黏附分子，既參與上皮組織的內(nèi)皮連接，也能夠作為單純皰疹病毒的受體，近年來，隨著對(duì)NECTIN4研究的深入，發(fā)現(xiàn)其也能作為麻疹病毒屬病毒的受體，例如充當(dāng)犬瘟熱病毒的受體[7, 11]。此外，NECTIN4屬于免疫球蛋白超家族，與脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(Poliovirus receptor，PVR)同源，因此又被稱為PVRL4[12]。

關(guān)于表達(dá)外源受體的研究很多，以犬瘟熱的另一個(gè)受體SLAM蛋白為例，有報(bào)道在猴腎Vero細(xì)胞和犬細(xì)胞上表達(dá)SLAM蛋白能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)犬瘟熱病毒的分離能力[13]，但是此前已經(jīng)有關(guān)于Vero細(xì)胞能夠分離犬瘟熱病毒的報(bào)道了，表達(dá)受體僅僅增強(qiáng)了Vero細(xì)胞對(duì)野生新突變的犬瘟熱病毒株的分離能力[14]。此外，亦有學(xué)者在超越病毒宿主范圍的細(xì)胞株上進(jìn)行表達(dá)受體建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的研究[15]，但是并未證明細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性發(fā)生改變。本研究的創(chuàng)新之處在于證明表達(dá)受體可以拓展病毒的宿主范圍，令牛腎細(xì)胞接受犬瘟熱病毒的感染。筆者推測，由于病毒的侵染復(fù)制的方式多種多樣，需要與宿主細(xì)胞多個(gè)蛋白的相互作用。有些蛋白在物種間具有高度保守性，例如負(fù)責(zé)mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯和免疫相關(guān)功能等，但是能夠幫助病毒吸附和入侵的受體蛋白卻具有特異性，因此沒有一株病毒可以感染所有宿主。然而，受體蛋白也許是限制病毒侵染細(xì)胞的因素之一，絕非全部，否則關(guān)于此方面的研究應(yīng)該有很多。表達(dá)了犬NECTIN4蛋白的MDBK-N4細(xì)胞株能夠發(fā)揮犬NECTIN4作為內(nèi)化受體的功能[11]，成功讓犬瘟熱病毒侵染到細(xì)胞內(nèi)并完成復(fù)制增殖的過程說明病毒進(jìn)入細(xì)胞后MDBK細(xì)胞中再無明顯限制犬瘟熱病毒復(fù)制增殖的因素。這一試驗(yàn)證明對(duì)于一些缺乏敏感細(xì)胞株的病毒，可以嘗試運(yùn)用一些成熟的細(xì)胞系通過表達(dá)外源受體的方式完成病毒的分離培養(yǎng)和研究[16]。

在疫苗工業(yè)中，以犬瘟熱病毒疫苗舉例，傳統(tǒng)的疫苗使用雞胚繁殖得到的病毒制成，過程無法監(jiān)測，大規(guī)模培養(yǎng)困難，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[17]。此后部分公司采用Vero貼壁細(xì)胞系作為培養(yǎng)犬瘟熱病毒的新宿主，受限于貼壁細(xì)胞系的性能，即使采用微載體培養(yǎng)，效率和成本也難以和懸浮培養(yǎng)相媲美。此外，微載體培養(yǎng)及其大型生物反應(yīng)器制造的相關(guān)專利仍然掌握在國外幾個(gè)大公司手中，在國內(nèi)推廣的成本很高[18]。如果運(yùn)用表達(dá)外源受體的方法，便可采用現(xiàn)有具備成熟培養(yǎng)工藝的懸浮細(xì)胞，例如CHO工程細(xì)胞株完成犬瘟熱病毒的培養(yǎng)，其產(chǎn)量、成本、過程的可控性將大大提升，工業(yè)前景廣闊[19]。此方法不僅可以用于犬瘟熱病毒疫苗的生產(chǎn)，亦可用于其他具備明確受體的病毒的培養(yǎng)，滿足疫苗工業(yè)在開發(fā)疫苗新品種時(shí)，對(duì)具備優(yōu)良性能細(xì)胞株的熱切需求[20]。