布魯氏菌RPA-LFD檢測(cè)方法的建立

于 博，李博宇，趙 博，李 東，李健明，時(shí) 坤，曾范利，宗 穎，杜 銳*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118)

布魯氏菌病簡(jiǎn)稱布病，是全球最常見(jiàn)且對(duì)經(jīng)濟(jì)有重要影響的人畜共患病之一[1]。目前在全球已發(fā)現(xiàn)有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)存在布魯氏菌病[2]。這種疾病的特征是導(dǎo)致動(dòng)物的流產(chǎn)、降低產(chǎn)奶量和生育能力，以及人的波狀熱，關(guān)節(jié)炎和骨髓炎[3]。布魯氏菌種屬有10種以上，但牛種、豬種、羊種布魯氏菌是布魯氏菌病發(fā)病的主要原因[4]，從感染人的布魯氏菌的血培養(yǎng)物中分離出來(lái)的大多數(shù)為羊種布魯氏菌，因此羊種布魯氏菌對(duì)人的致病力最強(qiáng)[3]。目前細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)是布魯氏菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]，但該方法危險(xiǎn)性高，對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，敏感性差。血清學(xué)檢測(cè)是布魯氏菌常用的檢測(cè)方法，其中凝集試驗(yàn)較為常用，但血清學(xué)方法敏感性低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和交叉反應(yīng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的診斷依賴于核酸分子檢測(cè)，目前針對(duì)布魯氏菌已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了基于PCR及其衍生技術(shù)的多種檢測(cè)技術(shù)，但大多數(shù)分子檢測(cè)都需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，并且耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)和偏遠(yuǎn)地區(qū)檢測(cè)存在一定的困難[6]。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)是2006年發(fā)明的一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[7]，該技術(shù)使用重組酶與引物結(jié)合形成的復(fù)合物能在模板上尋找同源序列，定位后就會(huì)引發(fā)鏈交換反應(yīng)并啟動(dòng)DNA合成，可在25℃～42℃恒溫，20 min內(nèi)條件下完成核酸擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果可以與凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光、側(cè)流層析試紙條等多種方法結(jié)合讀取。本研究將RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條結(jié)合，原理為羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的特異性探針與生物素(Biotin)標(biāo)記的特異性引物雜交擴(kuò)增出帶有雙標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其滴加于試紙條上便會(huì)與膠體金標(biāo)記的抗FAM抗體結(jié)合，形成三元復(fù)合物，當(dāng)流動(dòng)到檢測(cè)線時(shí)，生物素配體捕獲該復(fù)合物，形成檢測(cè)線；未雜交的FAM標(biāo)記探針與膠體金標(biāo)記的抗FAM抗體結(jié)合，形成不含有生物素的兩元復(fù)合物，結(jié)合在質(zhì)控線上[8]。RPA-LFD技術(shù)不需要通過(guò)復(fù)雜的儀器和設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，通過(guò)肉眼即可觀察到結(jié)果，更加適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，為今后布魯氏菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要實(shí)驗(yàn)材料 布魯氏菌S2、M5、A19疫苗株、維氏氣單胞菌、大腸桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌均由本實(shí)驗(yàn)室保存。34份鹿的血液樣品采集于吉林省鹿場(chǎng)。TwistAmpnfo和TwistAmp Basic試劑盒購(gòu)自英國(guó)Twist DX公司；MileniaGenlineHybriDetect 1(側(cè)流層析試紙條)購(gòu)自德國(guó)MileniaBiotec公司；Premix TaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye)和pMD18-T Vector Cloning Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒和組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司。引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒分別提取布魯氏菌S2疫苗株、維氏氣單胞菌、大腸桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌基因組，根據(jù)Gen-Bank中登錄的布魯氏菌Omp31基因(AY484527.1)保守序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以提取的布魯氏菌S2疫苗株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段回收純化后克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18-T-Omp31，經(jīng)PCR鑒定和重組質(zhì)粒測(cè)序后按照公式：拷貝數(shù)(copies/μL)=6.02×1023×質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)。

表1 Omp31引物Table 1 Primers of Omp31

1.3 RPA引物的設(shè)計(jì)與篩選 根據(jù)相關(guān)資料并結(jié)合TwistAmp Basic試劑盒說(shuō)明書設(shè)計(jì)RPA引物，參考Omp31基因保守序列設(shè)計(jì)9對(duì)引物(表2)，以拷貝數(shù)為106拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按照TwistAmp Basic試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RPA擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果經(jīng)2.5%凝膠電泳檢測(cè)，篩選最終可以擴(kuò)增出良好特異性條帶的引物為最佳引物。

1.4 RPA-LFD反應(yīng)條件的優(yōu)化 以篩選出的最佳引物按照TwistAmpnfo說(shuō)明書設(shè)計(jì)RPA-LFD引物和探針(表3)，以拷貝數(shù)為106拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在預(yù)添加nfo酶的凍干PCR管中加入如下預(yù)混液：上、下游引物各2.1 μL、探針0.6 μL、Primer Free Rehydration buffer(再水合緩沖液)29.5 μL、模板和水13.2 μL。在倒置的管蓋中加入2.5 μL MgOAc(醋酸鎂)，蓋上管蓋放入金屬浴中，利用方陣法對(duì)反應(yīng)溫度(20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、37℃、39℃、40℃、42℃)、時(shí)間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)、引物探針濃度(1 pmol/μL、5 pmol/μL、10 pmol/μL、25 pmol/μL、50 pmol/μL)等條件優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)液2 μL加入98 μL LFD緩沖液中混合靜止2 min，將側(cè)流層析試紙條插入混合緩沖液中靜止2 min～3 min，按照試紙條試劑盒說(shuō)明書判定結(jié)果。

表2 RPA引物Table 2 Primers for RPA sequence

表3 RPA-LFD引物和探針Table 3 Primers and probes for RPA-LFD sequence

1.5 特異性試驗(yàn) 以提取的布魯氏菌S2、M5、A19疫苗株、維氏氣單胞菌、大腸桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌基因組為模板，以最佳反應(yīng)條件進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)，同時(shí)以ddH2O為模板作為陰性對(duì)照，檢測(cè)該方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍倍比稀釋(106拷貝/μL～1拷貝/μL)，分別以稀釋的質(zhì)粒(104拷貝/μL～100拷貝/μL)為模板，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行RPA-LFD反應(yīng)，確定該方法的最小檢出量，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的敏感性，同時(shí)以篩選出的最佳引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增(質(zhì)粒模板濃度106拷貝/μL～100拷貝/μL)，將兩種方法的敏感性進(jìn)行對(duì)比分析。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 以3.1×104拷貝/μL～3.1×100拷貝/μL 10倍倍比稀釋的5個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按照最佳反應(yīng)條件將每個(gè)稀釋度的模板分別加入至單獨(dú)預(yù)添加nfo酶的凍干PCR管中，每次為獨(dú)立的反應(yīng)，進(jìn)行3次RPA-LFD批間重復(fù)試驗(yàn)，確定該檢測(cè)方法的重復(fù)效果。

1.8 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)從吉林省鹿場(chǎng)采集的34份加入抗凝劑的鹿血液樣品，按照血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，應(yīng)用已建立的RPA-LFD方法和常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 以布魯氏菌疫苗株S2為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示得到約700 bp的片段(圖略)，將擴(kuò)增片段回收純化后克隆至pMD18-T載體，經(jīng)PCR鑒定，測(cè)序結(jié)果均與預(yù)期一致，命名為pMD18-T-Omp31，經(jīng)微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)，濃度為116 ng/μL，換算為質(zhì)?？截悢?shù)為3.1×1010拷貝/μL。

2.2 RPA引物篩選結(jié)果 以106拷貝/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用9對(duì)引物進(jìn)行RPA基礎(chǔ)反應(yīng)，經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，引物對(duì)F1/R1相比于其它引物對(duì)擴(kuò)增的目的條帶更為特異清晰(圖1)，因此選用引物對(duì)F1/R1為最佳引物。

圖1 引物篩選結(jié)果Fig.1 Primer screening results

2.3 RPA-LFD反應(yīng)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，結(jié)果顯示，溫度在28℃～42℃(圖2A)，時(shí)間在10 min～30 min(圖2B)，引物探針濃度在5 pmol/μL～10 pmol/μL(圖2C)試紙條檢測(cè)線(T)均有條帶，最終確定該方法的優(yōu)化條件為：反應(yīng)溫度設(shè)定為39℃，時(shí)間為20 min，引物探針濃度均為10 pmol/μL。

圖2 不同溫度(A)、時(shí)間(B)、引物探針濃度(C)下RPA-LFD反應(yīng)Fig.2 RPA-LFD reaction at different temperatures(A),times(B),and prime probe concentration(C)

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測(cè)多種病原基因，進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，除布魯氏菌基因組檢測(cè)線(T)有特異性條帶外，維氏氣單胞菌、大腸桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌基因組檢測(cè)線(T)均無(wú)該條帶(圖3)，表明所建立的RPA-LFD檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖3 布魯氏菌RPA-LFD特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specilfic results of the RPA-LFD for Brucella

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 以3.1×106拷貝/μL～3.1×100拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，3.1×104拷貝/μL～3.1×100拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RPA-LFD試驗(yàn)，結(jié)果顯示常規(guī)PCR最低可檢測(cè)到3.1×103拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(圖4A)，而RPA-LFD可以檢測(cè)到3.1×101拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(圖4B)，所建立的RPA-LFD檢測(cè)方法比常規(guī)PCR敏感性高100倍，表明該方法敏感性高。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 以3.1×104拷貝/μL～3.1×100拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行3次RPA-LFD批間重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，RPA-LFD檢測(cè)方法均可檢測(cè)出最低限為3.1×101拷貝/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(圖5)。表明該檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

圖4 常規(guī)PCR(A)和RPA-LFD(B)敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Sensitivity results of PCR(A)and RPA-LFD(B)

圖5 RPA-LFD重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of RPA-LFD repeatability test

2.7 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 將采集的34份鹿血液樣品提取基因組進(jìn)行常規(guī)PCR和RPA-LFD檢測(cè)，結(jié)果均顯示3份樣品為陽(yáng)性，所建立的RPA-LFD檢測(cè)方法與常規(guī)PCR檢出符合率為100%，表明所建立的RPA-LFD檢測(cè)方法可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3 討論

本研究將RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條結(jié)合用于檢測(cè)布魯氏菌，在39℃，20 min的反應(yīng)條件下，5 min內(nèi)即可觀察到肉眼可見(jiàn)的結(jié)果。目前，RPA檢測(cè)技術(shù)在細(xì)菌、病毒、寄生蟲等領(lǐng)域均有涉及，Wang等對(duì)豬圓環(huán)病毒(PCV3)建立了實(shí)時(shí)重組酶聚合酶(RT-RPA)檢測(cè)方法，其在38℃反應(yīng)20 min即可完成檢測(cè)，且最低可以檢測(cè)到23個(gè)拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，特異性強(qiáng)，所建立的RT-RPA檢測(cè)方法與熒光定量PCR性能相當(dāng)，但RT-RPA反應(yīng)更快，有望實(shí)現(xiàn)快速靈敏地檢測(cè)PCV3，從而有助于預(yù)防和控制PCV3感染的疾病[9]。高建欣等建立了RPALMTS(乳膠微球試紙)用來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌，15 min即可檢測(cè)到最低500 fg DNA和1.2×101cfu/mL純菌液，可應(yīng)用于基層單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌[10]。Sun等針對(duì)日本血吸蟲SjR2基因建立了RPA-LFD檢測(cè)方法，最低可檢測(cè)到5 fg DNA，與qPCR和實(shí)時(shí)RPA敏感性相同，在25℃～45℃，15 min～20 min條件下即可完成，相比傳統(tǒng)ELISA和IHA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)效果好，在現(xiàn)場(chǎng)具有很大的應(yīng)用價(jià)值[11]。

RPA技術(shù)在擁有檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度高，在常溫下即可進(jìn)行反應(yīng)，甚至人體體溫即可提供反應(yīng)所需的溫度環(huán)境，讀取結(jié)果多樣化的優(yōu)勢(shì)外，同時(shí)也存在著許多問(wèn)題，其一在于沒(méi)有專業(yè)軟件對(duì)RPA引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，應(yīng)根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行篩選；其二在于容易造成擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，操作盡量在通風(fēng)性好，空曠的環(huán)境條件下，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書設(shè)計(jì)引物探針，避免引物探針發(fā)生雜交而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。為避免假陰性結(jié)果出現(xiàn)，模板核酸的質(zhì)量、引物和探針的特異性應(yīng)得到保證；其三在于存在噪音現(xiàn)象，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，陰性對(duì)照可能會(huì)在試紙條上出現(xiàn)微弱的檢測(cè)線[12]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在2 min以內(nèi)便可讀取結(jié)果，因此盡量在最短時(shí)間內(nèi)讀取為宜；其四在于成本高，由于RPA技術(shù)目前應(yīng)用尚不廣泛，成本較高，本研究嘗試將50 μL體系減半為25 μL體系，結(jié)果顯示體系減半后并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這將有效的控制成本，但隨著該技術(shù)的不斷成熟和發(fā)展，成本將在未來(lái)進(jìn)一步降低。RPA-LFD對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)具有巨大的優(yōu)勢(shì)，但DNA的提取對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)還是有一定的困難，楊洋建立了基于磁珠的現(xiàn)場(chǎng)核酸提取方法，與RPA-LFD聯(lián)用，使整個(gè)過(guò)程脫離實(shí)驗(yàn)室的束縛，真正的使RPA-LFD應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[13]。綜上所述，本研究建立了一種簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的布魯氏菌RPA-LFD檢測(cè)方法，為今后布魯氏菌病的現(xiàn)場(chǎng)診斷提供了幫助。