豬源沙門氏菌聚合酶螺旋反應(yīng)方法的建立與應(yīng)用

胡瑞鴻，從秋實(shí)，李艷飛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030)

沙門氏菌是一類能夠?qū)е氯诵蠊不技膊〉氖吃葱灾虏【渚鷮傺逍头倍嗲铱乖瓘?fù)雜，可以在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)寄生生存，對(duì)人和畜禽健康帶來很大的危害，常給發(fā)展中國(guó)家的畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著我國(guó)畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，豬的養(yǎng)殖數(shù)量越來越多，許多地區(qū)豬的養(yǎng)殖已經(jīng)形成集約化、規(guī)?；酿B(yǎng)殖模式，但隨之而來的各種動(dòng)物源傳染病也給集約化養(yǎng)殖帶來了新的挑戰(zhàn)。其中，豬源沙門氏菌病即豬副傷寒，是一種由沙門氏菌屬細(xì)菌引起的傳染病，主要感染斷奶期仔豬，臨床上以急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢為特征[1-2]。在集約化豬場(chǎng)中一旦暴發(fā)沙門氏菌和其它細(xì)菌的混合感染，很難對(duì)其診斷和對(duì)癥治療[3]，因此快速、準(zhǔn)確、有效地檢測(cè)豬源沙門氏菌感染對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。

目前，傳統(tǒng)的檢測(cè)豬源沙門氏菌的方法主要包括細(xì)菌培養(yǎng)法、生化和血清學(xué)鑒定及免疫學(xué)檢測(cè)等，其中細(xì)菌分離培養(yǎng)法被視為沙門氏菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，檢測(cè)結(jié)果可信度高，但檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)，操作步驟較為繁瑣，且所需試劑繁多，使其在應(yīng)用方面具有一定的局限性[4-5]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法(如PCR)因具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，已被廣泛用于多種病原微生物的檢測(cè)，雖縮短了檢測(cè)時(shí)間，但往往需購(gòu)買昂貴的設(shè)備和耗材，且需要專業(yè)的操作人員而限制了其在基層防疫部門的推廣普及[6]。因此，亟待建立一種快速、敏感、有效的方法用于豬源沙門氏菌的檢測(cè)。

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確且無需昂貴檢測(cè)儀器等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)，其中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且成本低的特點(diǎn)，目前已被用于豬源沙門氏菌的檢測(cè)[7-8]。聚合酶螺旋反應(yīng)(Polymerase spiral reaction，PSR)是繼LAMP方法后被大力推廣的一項(xiàng)新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，與LAMP擴(kuò)增原理類似，在2～4條特異性引物和具有鏈置換活性Bst-DNA聚合酶的作用下可在恒溫條件下完成對(duì)靶基因的快速擴(kuò)增，因具有引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效率高且不需昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)而取得良好的應(yīng)用效果[9-11]。本研究以豬源沙門氏菌侵襲蛋白A(Invasion protein A，invA)保守序列作為靶基因設(shè)計(jì)PSR特異性擴(kuò)增引物，建立一種快速、高效且靈敏的方法，以期為基層獸醫(yī)單位提供新型的豬源沙門氏菌檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Trans 2k plus II DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取純化試劑盒、dNTPs、MgCl2均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；甜菜堿購(gòu)自Sigma-Aldrich有限公司；瓊脂糖購(gòu)自北京沃比森科技有限公司；SYBR Green I染料購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Bst-DNA聚合酶大片段購(gòu)自NEB(北京)有限公司；TaqManTMFast Advanced Master Mix試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨、氯化鈉、DBI-05干制生化鑒定試劑盒均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 菌株來源 乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi β，CMCC 50094)、豬霍亂沙門氏菌(S.cholerae-suis，CMCC 50018)、大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 25922)、E.coli(C83930)、E.coliO157：H7、E.coli(C83093)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)、S.aureus(ATCC29212)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，ATCC12453)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，ATCC7966)、單核細(xì)胞李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，ATCC19115)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica，ATCC23715)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，ATCC27519)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。本研究自2017年～2018年間共采集黑龍江和吉林部分地區(qū)12個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)共132份疑似豬源沙門氏菌臨床腹瀉樣本，用無菌拭子蘸取糞便后放入含無菌PBS的采集管中，并在12 h內(nèi)低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌的分離及純化。

1.3 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的豬沙門氏菌侵襲蛋白A(invA)保守基因(MK017942.1)，參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)3套PSR特異性引物(表1)；LAMP特異性引物和熒光定量PCR引物分別參照文獻(xiàn)[12-13]。

1.4 DNA模板的制備 將保存的14株不同菌株接種至滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于37℃條件下培養(yǎng)12 h～18 h，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取豬源沙門氏菌和其它致病菌的DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 擴(kuò)增引物Table 1 Primers used in PSR assay

1.5 PSR擴(kuò)增引物的篩選與反應(yīng)體系的優(yōu)化 首先對(duì)3套PSR特異性引物進(jìn)行篩選，反應(yīng)體系為25μL：包括2.5 mmol/LdNTPs 2 μL、20 mmol/L MgCl22.5 μL、10×Thermo-Pol Buffer 2.5 μL、0.8 mol/L Betaine 2 μL、Bst DNA聚合酶1 μL(8 U/管)、乙型副傷寒沙門氏菌CMCC 5009 4株基因組DNA 2 μL。SPSR-1、SPSR-2和SPSR-3引物量分別為：FT和BT各1.6 μL，IF和IB各0.8 μL，并用滅菌去離子水補(bǔ)齊反應(yīng)體系。反應(yīng)于65℃條件下孵育60 min，用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)；反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)管內(nèi)加入1 μL SYBR Green I染料混勻，分別在白光和紫外燈下觀察，并經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分析以篩選最佳的PSR引物。

為確定PSR法的最優(yōu)反應(yīng)條件，選擇最佳的特異性引物組合并采用方陣法優(yōu)化體系的孵育溫度(61℃、63℃、65℃、67℃、69℃)、dNTPs濃度(0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L)、Mg2+濃 度(1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L)、Bst聚合酶濃度(6 U/管、8 U/管、10 U/管、12 U/管)及反應(yīng)時(shí)間(15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)，每個(gè)反應(yīng)均重復(fù)3次，并用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析。

1.6 特異性試驗(yàn) 以提取的14株實(shí)驗(yàn)菌(2株豬源沙門氏菌和12株其它致病菌)DNA為模板分別進(jìn)行LAMP法和PSR法進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)滅菌去離子水為模板作為陰性對(duì)照。LAMP反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[12]，反應(yīng)結(jié)束后，分別向反應(yīng)管內(nèi)加入1 μL SYBR Green I混勻并分別于白光和紫外燈下觀察，同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 敏感性試驗(yàn) 以增菌培養(yǎng)后的豬源沙門氏菌參考株CMCC 50094菌液為模板并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，調(diào)整初始菌液濃度為5×106cfu/mL，分別將菌液稀釋到濃度為5×105cfu/管、5×104cfu/管、5×103cfu/管、5×102cfu/管、5×101cfu/管、25 cfu/管、10 cfu/管和5 cfu/管，9個(gè)稀釋度備用；分別吸取2 μL稀釋后的各菌液作為模板分別進(jìn)行PSR、LAMP和熒光定量PCR擴(kuò)增，比較3種檢測(cè)方法的敏感性。

1.8 臨床樣本檢測(cè) 對(duì)2017年～2018年間于黑龍江和吉林部分地區(qū)采集的共132份豬源臨床腹瀉樣本按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌的分離、純化培養(yǎng)及生化鑒定，于無菌條件下接種到肉湯固體培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)12 h～18 h，挑取疑似沙門氏菌菌落用DBI-05干制生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定，并以其結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)。隨后，將這些腹瀉樣品經(jīng)常規(guī)處理后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以其為模板，利用本研究建立的PSR法對(duì)上述132份臨床腹瀉樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 PS R引物的篩選 以乙型副傷寒沙門氏菌CMCC 50094標(biāo)準(zhǔn)株DNA為模板，分別以SPSR-1、SPSR-2和SPSR-3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，在相同條件下3套PSR特異性引物反應(yīng)擴(kuò)增速度及效率由高到低依次為SPSR-2、SPSR-3、SPSR-1(圖1A)；SPSR-2擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，陽(yáng)性產(chǎn)物呈階梯狀分布，而陰性對(duì)照無條帶(圖1B)；向反應(yīng)管內(nèi)加入SYBR Green I染料后，白光下可見陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果呈綠色，陰性為橙色(圖1C)；紫外光下觀察，陽(yáng)性管內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，而陰性管顏色無變化(圖1D)。表明本研究設(shè)計(jì)的3套特異性引物中，SPSR-2組合(SPSR-2 PSR)獲得的擴(kuò)增效果最好。

圖1 SPSR-2引物組PSR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of SPSR-2 PSR

2.2 PSR反應(yīng)條件的優(yōu)化 選擇SPSR-2組作為PSR法特異性引物，分別對(duì)各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，PSR反應(yīng)溫度為63℃(圖2A)、dNTPs濃度為0.3 mol/L、Mg2+終濃度為2.0 mmol/L、Bst酶濃度為8 U/管、擴(kuò)增時(shí)間為60 min擴(kuò)增效率最高(圖2B)。

圖2 PSR反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of PSR reaction conditions

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 以滅菌后的去離子水做模板為陰性對(duì)照，選取2株豬源沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌和其它12株致病菌的DNA分別進(jìn)行LAMP法和PSR法的特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，LAMP法和PSR法均可以特異性擴(kuò)增2株豬源沙門氏菌，而陰性對(duì)照和其它12株致病菌無擴(kuò)增(圖3)；在反應(yīng)管內(nèi)加入SYBR Green I染料后，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物在白光下觀察呈現(xiàn)綠色，陰性為淡橙色(圖3C、3D)；紫外燈下觀察陽(yáng)性擴(kuò)增呈綠色熒光，而陰性管內(nèi)無變化(圖3E、3F)；2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析可見陽(yáng)性產(chǎn)物呈梯形條帶，陰性對(duì)照和其余菌株均未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物(圖3A、3B)。結(jié)果表明，建立的PSR法與LAMP法均可以特異性地檢測(cè)出豬源沙門氏菌，而與其它致病菌無交叉反應(yīng)。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將過夜培養(yǎng)的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC 50094菌液10倍倍比稀釋后分別進(jìn)行LAMP、PSR和熒光定量PCR方法的敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，本研究建立的PSR法的敏感性與熒光定量PCR法相同，檢測(cè)下限均為5×101cfu/mL(圖4A、4C)，而LAMP方法的檢測(cè)靈敏度為5×102cfu/mL(圖4B)，結(jié)果表明，本研究建立的PSR方法的敏感性較高，且略高于LAMP方法。

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The specificity assays of PSR and LAMP amplification

2.5 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)法和生化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果作為參照，對(duì)采集的132份疑似豬源沙門氏菌臨床腹瀉樣本進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過細(xì)菌的分離、純培養(yǎng)和生化試驗(yàn)，共檢測(cè)出攜帶豬源沙門氏菌陽(yáng)性樣本18份。采用本研究建立的PSR法對(duì)采集的132份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，同樣檢測(cè)出18份陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性檢出率為13.64%，且結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)法和生化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果相符(表2)。表明PSR法可以快速、準(zhǔn)確地完成對(duì)臨床樣本的檢測(cè)。

3 討論

圖4 LAMP、PSR和熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The sensitivity analysis of LAMP,PSR and real-time PCR

表2 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Table 2 The detection results of clinical samples

豬源沙門氏菌作為引發(fā)斷奶仔豬副傷寒的主要因素，目前疫苗接種和抗生素治療仍是防治該病的主要手段。在患病早期以一種快速、有效的方法對(duì)豬群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以在一定程度上減小豬源沙門氏菌造成的經(jīng)濟(jì)損失。本研究建立的PSR法是一種新型、快速的基因檢測(cè)技術(shù)，不僅不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備及昂貴耗材，同時(shí)擺脫了LAMP方法的專利限制，可以實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)完成目的基因的大量擴(kuò)增，現(xiàn)已廣泛用于食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[14]。本研究選擇沙門氏菌invA保守基因作為靶序列設(shè)計(jì)特異性引物，該基因表達(dá)的侵襲蛋白存在于所有沙門氏菌中且決定細(xì)菌進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞的能力，與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，以此為靶基因設(shè)計(jì)的PSR特異性引物保證了檢測(cè)方法的可行性。此外，PSR法引物設(shè)計(jì)更加簡(jiǎn)單方便，加速引物的使用可提升反應(yīng)效率，實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)靶基因的大量擴(kuò)增。特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，PSR法與之前建立的LAMP方法相比，兩者具有相同的特異性，均可特異性地檢測(cè)出豬源沙門氏菌，而對(duì)12株其他致病菌無擴(kuò)增反應(yīng)；但前者的敏感性較高，檢測(cè)下限可達(dá)5×101cfu/mL，為L(zhǎng)AMP法的10倍，可承擔(dān)對(duì)更低細(xì)菌濃度的檢測(cè)任務(wù)。此外，應(yīng)用PSR法對(duì)分離的132份疑似豬源沙門氏菌腹瀉樣本進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果一致，說明PSR法作為新型、快速檢測(cè)手段可以完成對(duì)豬源沙門氏菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。此外，由于本實(shí)驗(yàn)臨床樣本數(shù)量較少，雖然PSR具有較高敏感性，且檢測(cè)結(jié)果中無假陽(yáng)性出現(xiàn)，但為了達(dá)到基層獸醫(yī)部門的使用要求，還須更多的臨床樣本對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和檢驗(yàn)。

本研究選擇瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)PSR法和LAMP法的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，但在制膠過程中需要用溴化乙錠染色，該試劑因具有強(qiáng)致癌性而危害人體健康，應(yīng)盡量減少該染料的使用。因此本研究選擇SYBR Green I染料為反應(yīng)的指示劑，在反應(yīng)結(jié)束后向管內(nèi)滴加少量的染料即可對(duì)反應(yīng)結(jié)果做出判定，提高了PSR法的檢測(cè)效率。但由于反應(yīng)結(jié)束后管內(nèi)會(huì)產(chǎn)生的大量氣溶膠，一旦打開反應(yīng)管會(huì)對(duì)周圍環(huán)境造成污染。目前，已有學(xué)者設(shè)計(jì)出了用于LAMP法的恒溫反應(yīng)管，可在反應(yīng)結(jié)束后不開蓋而添加熒光染料，克服了開蓋產(chǎn)生氣溶膠污染的缺陷，但由于價(jià)格昂貴限制了該反應(yīng)管在基層部門的普及[15]。

綜上所述，本研究所建立的快速檢測(cè)豬源沙門氏菌的PSR法，不僅具有時(shí)間短、成本低、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，且不需要依賴復(fù)雜儀器設(shè)備與專業(yè)的技術(shù)操作，適合在基層獸醫(yī)部門推廣應(yīng)用。