北美型豬繁殖與呼吸綜合征競爭ELISA抗體檢測方法的建立及初步應(yīng)用

李宛生，李敏華，楊建偉，田志軍，王 倩*，冷超糧*

(1.南陽師范學(xué)院，河南 南陽473061；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點豬病實驗室，黑龍江 哈爾濱150069；3.北京愛德士元亨生物科技有限公司，北京101318)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸道疾病為主要特征的高度接觸性傳染疾病[1]。特別是2006年以來，我國及周邊國家出現(xiàn)以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為主要特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)[2-3]，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，且該病毒可以侵害免疫系統(tǒng)造成持續(xù)感染，當前普遍通過免疫疫苗的方式進行防控，但是疫苗的大量使用使該疫病的流行情況日益復(fù)雜多變，因此建立PRRSV抗體的快速診斷方法，對我國豬群PRRS流行病學(xué)調(diào)查及免疫前后抗體水平持續(xù)監(jiān)測評估具有重要指導(dǎo)意義。

目前，在眾多PRRSV的檢測方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作簡便、快速敏感、易于標準化，非常適合用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測[4]。國內(nèi)外學(xué)者基于不同的PRRSV蛋白已經(jīng)建立了多種ELISA方法，主要以核衣殼蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5)作為包被抗原的這兩類方法最為成功。吳雪軍曾對這兩類方法具有代表性的商品化試劑盒進行比較，結(jié)果顯示兩種ELISA方法具有較高的符合率和一致性，但對于不同背景的豬場要根據(jù)自身情況選擇試劑盒種類[5]。N蛋白雖然高度保守且具有良好的抗原性和免疫原性，在感染后7 d即可檢出對應(yīng)抗體，抗體持續(xù)時間可達數(shù)月，但不能刺激豬體產(chǎn)生中和抗體，無法反應(yīng)豬體的免疫情況，不適合對疫苗的免疫效果進行檢測和評估[6]；而膜蛋白中的M蛋白在歐美株間的同源性較高，免疫原性強，在PRRSV感染后約10 d即可從豬血清中檢測到針對M蛋白的抗體[7]，抗體水平持續(xù)時間長，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答和中和抗體，并可增強GP5誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，彌補了N蛋白作為抗原的ELISA方法無法反映機體真實免疫狀況的不足[8-9]，所以M蛋白也可作為疫苗與診斷試劑研究的理想候選抗原。

目前我國主要以經(jīng)典株、高致病性株、NADC30-like株等北美型PRRSV為主要流行毒株[10-11]，基于此流行現(xiàn)狀，本研究以抗北美型PRRS M蛋白的單克隆抗體(MAb)為競爭抗體，建立了一種快速檢測北美型PRRSV M蛋白抗體水平的競爭ELISA(competitive-ELISA，C-ELISA)方法，為PRRS的流行病學(xué)調(diào)查、臨床上疫苗評估及免疫前后抗體水平監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒和血清 HP-PRRSV(HuN4-F112)株由本實驗室分離的HuN4強毒在MARC-145細胞連續(xù)傳112代獲得[12]。HuN4-F112株的高免血清(PRRSV標準陽性血清)、PRRSV標準陰性血清(采自SPF豬)、109份陰性和73份北美型PRRSV陽性血清、歐洲型PRRSV(DV株)陽性血清、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等豬常見病毒陽性血清以及北美型PRRSV經(jīng)典株CH-1R、高致病性株HuN4-F112、NADC30-like株SDHS53、NADC34-like株DZD32(動物實驗第14 d采集，未公開發(fā)表)豬陽性血清均由本實驗室制備保存；546份臨床血清采自黑龍江省部分豬場；抗北美型PRRSV M蛋白MAb 1C8由本實驗室制備和保存[13]。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清(FBS)購自Ausbian公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購自Invitrogen公司；BCA蛋白濃度定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；ELISA包被板購自Costar公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司；PRRSV抗體檢測試劑盒購自北京愛德士(IDEXX)元亨生物科技有限公司。

1.3 抗原的制備及純化 HuN4-F112株病毒培養(yǎng)上清由維科公司提供，反復(fù)凍融后將β-丙內(nèi)酯和病毒液上清按1∶2 000混合，4℃24 h滅活，接種細胞檢測滅活效果之后，10 000 r/min離心30 min，取上清液40 000 r/min離心4 h，PBS重懸沉淀后再次低速離心，上清即為純化的全病毒，采用BCA蛋白濃度定量試劑盒測定濃度后于-80℃保存。

1.4 C-ELISA方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 將純化的全病毒用碳酸鹽包被液梯度稀釋(1∶100～1∶700)，100 μL/孔加樣后4℃過夜；洗滌液洗滌3次，每孔加入300 μL 1%的BSA，37℃封閉1.5 h，洗滌3次，用樣品稀釋液將競爭抗體PRRSV M蛋白MAb連續(xù)稀釋(1∶1～1∶7)后分別取50 μL與等體積的PRRSV陰陽性標準血清混勻加入到ELISA板中，37℃孵育30 min；棄去混合液，洗滌3次，加入100 μL山羊抗鼠IgG-HRP二抗(1∶10 000)，37℃孵育30 min；棄去二抗，洗滌3次，加入底物顯色液100 μL/孔，37℃避光顯色15 min，每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)；測定OD450nm值，計算抑制率(percentage inhibition，PI)，PI(%)=(1-陽性血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值)×100%，PI值最大的反應(yīng)孔中使用的抗原包被濃度和競爭抗體稀釋度即為最佳使用濃度。

按照上述確定條件，采用方陣滴定法[14]，對封閉時間(1 h、1.5 h、2 h)、最佳血清稀釋度(1∶2～1∶2 048)、最佳被檢血清作用時間(10 min、20 min、30 min)、酶標二抗稀釋度(1∶1 000～1∶10 000)、底物顯色時間(5 min、10 min、15 min)等條件進行優(yōu)化。

1.5 陰陽臨界值的確定 109份已知陰性血清和73份北美型PRRSV陽性血清，按照優(yōu)化的C-ELISA方法檢測，測定OD450nm值后按如下公式轉(zhuǎn)換為PI，PI=(1-OD450nm被檢血清/OD450nm陰性血清)×100%，用MedCalcv15.8軟件進行ROC曲線和交互式點圖分析，確定臨界值。

1.6 特異性試驗 按照優(yōu)化的C-ELISA條件檢測PRV、PCV2、CSFV、PEDV、TGEV、歐 洲 型PRRSV(DV株)、北美型PRRSV代表株CH-1R株、SDHS53株、DZD32株豬陽性血清，設(shè)立標準的北美型PRRSV陽性血清(HuN4-F112株)對照，根據(jù)臨界值判定檢測血清樣本的陰陽性，評估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 PRRSV標準陽性血清2倍倍比(1∶2～1∶2 048)稀釋，按優(yōu)化的C-ELISA條件進行檢測，根據(jù)臨界值判定陰陽性，評估該方法的敏感性。同時使用IDEXX PRRSV試劑盒對上述血清進行檢測，比較二者的敏感性差異。

1.8 重復(fù)性試驗 按照優(yōu)化的C-ELISA方法，從同一批次包被的ELISA板和不同批次包被的ELISA板中各挑取3塊，分別檢測5份血清樣本，每份樣品重復(fù)3次，進行批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗，對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9 臨床樣品的檢測 按照C-ELISA方法，對從黑龍江地區(qū)部分豬場收集的546份豬血清樣本進行檢測，并和商品化IDEXX PRRSV抗體檢測試劑盒同時檢測，比較二者的結(jié)果并計算二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 抗原的制備 超離純化后PRRSV全病毒經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其濃度為1.32 mg/mL。

2.2 C-ELISA方法的建立及反應(yīng)條件的確定 經(jīng)方陣滴定法建立的C-ELISA方法的最佳反應(yīng)條件見表1。

表1 C-ELISA檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化Table 1 The optimized conditions of C-ELISA

2.3 C-ELISA臨界值的確定 按最終優(yōu)化條件的C-ELISA方法檢測109份已知的PRRSV陰性血清和73份陽性血清，MedCalcv15.8軟件分析結(jié)果顯示，當敏感性為100%，特異性為98.2%時，其最優(yōu)的cut-off值為0.2565(圖1)。因此，當血清樣品的PI≥25.65%時，判定結(jié)果為陽性，當血清樣品的PI<25.65%時，判定為陰性。

圖1 陰陽性樣品臨界值的ROC曲線分析Fig.1 Receiver operating characteristic(ROC)analysis of negative and positive sample critical values

2.4 特異性試驗結(jié)果 利用該C-ELISA方法檢測PRV、PCV2、PEDV、CSFV、TGEV及PRRSV歐洲型(DV株)、北美型PRRSV經(jīng)典株CH1R、高致病性 株 HuN4-F112、 NADC30-like 株 SDHS53、NADC34-like株DZD32豬陽性血清，結(jié)果顯示該方法僅能與北美型PRRSV陽性血清抗體特異性競爭結(jié)合包被抗原，檢測結(jié)果為陽性，其它豬病毒陽性血清PI值均低于臨界值(圖2)，表明本研究建立的C-ELISA方法具有較強的特異性。

2.5 敏感性試驗結(jié)果 利用建立的C-ELISA方法檢測2倍倍比稀釋的PRRSV陽性血清，結(jié)果顯示PRRSV陽性血清稀釋倍數(shù)為1∶128時抑制率仍大于臨界值；IDEXX試劑盒檢測結(jié)果顯示，最高能檢出1 280倍稀釋的北美型PRRSV標準陽性血清(圖3)。表明本研究建立的C-ELISA方法具有較高的敏感性。

圖2 C-ELISA特異性試驗結(jié)果Fig.2 Results of the specificity test for C-ELISA

圖3 C-ELISA敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Results of the sensitivity test for C-ELISA

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果 利用建立的C-ELISA方法，進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于10%(表2)，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.7 臨床樣品的檢測 對本實驗室2018年從黑龍江地區(qū)部分豬場采集的546份臨床血清樣本采用該C-ELISA方法和IDEXX商品化PRRSV抗體檢測試劑盒同時檢測，結(jié)果顯示用本研究建立的方法檢測有519份血清樣品為陽性，27份血清為陰性，陽性率為95.1%；IDEXX商品化PRRSV抗體試劑盒檢測有532份血清樣本為陽性，14份陰性，陽性率為97.4%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，該C-ELISA方法與IDEXX商品化PRRSV抗體檢測試劑盒的總體符合率為95.8%，部分類型豬只抗體陽性率及與IDEXX商品化PRRSV抗體檢測試劑盒的符合率如表3所示。表明本研究建立的C-ELISA方法可以用于檢測臨床血清樣品。

表2 批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測結(jié)果Table 2 The results of intra-and inter-batch of repeatability test for C-ELISA

表3 不同類型豬的PRRSV抗體競爭ELISA檢測結(jié)果Table 3 Results of PRRSV antibody detection for different types of swine by C-ELISA

3 討論

在PRRSV感染早期實現(xiàn)對PRRS的快速準確診斷，能夠最大限度的控制PRRS的發(fā)生和流行。ELISA方法因其敏感性高、特異性強及短時間內(nèi)檢測大量樣品的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于實驗室檢測。

本研究通過超離純化獲得的全病毒作為包被抗原，相比于人工表達的抗原蛋白，保留了抗原表位的天然構(gòu)象，提高了抗體的結(jié)合準確度；以抗北美型PRRSV MAb為競爭抗體，特異性的PRRSV MAb與豬血清中PRRSV抗體競爭結(jié)合抗原蛋白，比阻斷ELISA方法更簡便省時，相比于市售大多數(shù)間接ELISA方法一定程度上可以減少假陽性的出現(xiàn)，敏感性和特異性更強，提高了檢測的準確性；且M蛋白在不同病毒株間的同源性高，免疫原性強，在感染早期就能檢測到相應(yīng)抗體，持續(xù)時間長，是疫苗開發(fā)與早期診斷研究的理想候選抗原。

特異性試驗中，因中國已報道的歐洲型PRRSV分離株均屬于基因1型中的I亞型[15]，且不同的歐洲株病毒分離困難，陽性血清難以獲得，因此選擇已有的同屬基因1型中I亞型的DV株陽性血清代表我國出現(xiàn)的歐洲株，在后續(xù)試驗中應(yīng)增加不同歐洲株血清的特異性試驗，而北美型PRRSV血清則以我國北美型PRRSV主要流行株的陽性血清為代表；間接ELISA方法相比于C-ELISA的敏感性更高，但C-ELISA方法特異性更強，敏感性試驗顯示，該方法能檢測出128倍稀釋的標準陽性血清，這也可能與豬體內(nèi)針對M蛋白和N蛋白的抗體水平差異相關(guān)；批內(nèi)試驗變異系數(shù)為0.7%～4.25%，批間試驗變異系數(shù)為1.4%～6.2%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

采用建立的C-ELISA方法檢測現(xiàn)地已知背景的546份血清，結(jié)果顯示本研究建立的C-ELISA方法與商品化IEDXX ELISA試劑盒總體符合率高達95.8%，整體陽性率高達95.1%，這與這些豬場普免的現(xiàn)狀是密切相關(guān)的，通過疫苗免疫使豬群整體產(chǎn)生了較高的PRRSV抗體水平；本研究C-ELISA方法和IDEXX試劑盒符合率差異主要集中在對仔豬的檢測中，這可能與兩種方法檢測針對抗原蛋白的差異造成的，IDEXX試劑盒主要是針對N蛋白，而本方法是針對M蛋白，仔豬通過母豬獲得母源抗體，不同周齡仔豬攜帶的母源抗體中M蛋白和N蛋白水平也不同，但M蛋白抗體水平與中和抗體相關(guān)性更高，因此本方法檢測結(jié)果可以為仔豬免疫時機提供參考依據(jù)；另外，本次檢測的現(xiàn)地血清樣本大多采自免疫疫苗的豬場，陰性個體數(shù)量較少，應(yīng)該收集更多陰性豬群臨床血清樣本，為標準化試劑盒的研制提供更多的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究建立了一種快速檢測北美型PRRSV M蛋白抗體水平的C-ELISA方法，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為臨床上PRRS的流行病學(xué)調(diào)查、豬群免疫疫苗前后抗體水平監(jiān)測提供了一種簡便、快速、特異的血清學(xué)抗體檢測方法，為標準化的檢測或診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。