三株鴨源H7N2亞型禽流感病毒的遺傳進化分析及其致病性研究

李 梅，尹 馨，侯玉杰，鄧國華，崔鵬飛，房敬真，施建忠，陳化蘭

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室，黑龍江哈爾濱150069)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科，A型流感病毒屬。根據(jù)其抗原性的差異，可將其分為16種不同的HA亞型和9種不同的NA亞型。H7亞型AIV宿主范圍廣泛，亞型組合眾多，在自然界中存在時間較長。自1902年在意大利雞群中首次發(fā)現(xiàn)H7N7亞型AIV以來，該病毒已在野鳥和家禽中廣泛存在[1]。2003年，我國學(xué)者在無明顯臨床癥狀的雞體內(nèi)首次分離到低致病性H7N2亞型AIV[2](注：本文中若不特殊說明，低致病性AIV和高致病性AIV均指對家禽中雞的致病性)。2013年初，我國上海市首次出現(xiàn)人感染H7N9亞型禽流感病例，隨后該疫情在安徽、江蘇等地出現(xiàn)，導(dǎo)致了人們對該病的恐慌[3]。截止2019年3月，該亞型病毒已導(dǎo)致我國1 567人感染發(fā)病，其中615個患者死亡，構(gòu)成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅(www.who.int/influenza/human animal interface/influenza H7N9/en/)。2014年2月，吉林省出現(xiàn)人感染H7N9 AIV事件，研究人員在患者家中的雞群中同時分離到低致病性H7N2和H9N2亞型AIV?；蚍治鲲@示，該H7N2亞型AIV為H7N9和H9N2亞型AIV的重組病毒[4]。2017年初我國出現(xiàn)高致病性H7N9亞型AIV后，2018年又在福建省的鴨群中陸續(xù)出現(xiàn)高致病性鴨源H7N2亞型AIV，對其進行系統(tǒng)分析后顯示，該株高致病性鴨源H7N2亞型AIV的HA基因與高致病性H7N9亞型AIV的HA基因高度同源，并且該株高致病性H7N2 AIV對雞鴨均100%致死[5]。這些研究結(jié)果表明，H7N2亞型AIV對家禽以及人類健康均造成了嚴(yán)重的威脅。因此，應(yīng)加強對H7N2亞型AIV的持續(xù)監(jiān)測。

2012年～2015年期間，在動物流感病毒的常規(guī)監(jiān)測中，本研究室在浙江和湖南省活禽市場的水禽中分離到3株低致病性鴨源H7N2亞型AIV，為了解該亞型AIV的進化及評估該病毒對動物和人的致病性風(fēng)險，本研究室對上述3株鴨源H7N2亞型AIV開展了遺傳演化分析及其對家禽和哺乳動物小鼠的致病性研究，為H7N2 AIV的持續(xù)監(jiān)測及科學(xué)防控禽流感提供數(shù)據(jù)支撐，并評估可能導(dǎo)致人類感染該亞型AIV的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 H7N2亞型AIV DK/ZJ/S3192/2012、DK/HuN/S1515/2014和DK/HuN/SD038/2015株由國家禽流感參考實驗室于2012年～2015年期間分離自浙江和湖南省活禽市場的水禽。6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司；6周齡SPF雞、3周齡SPF鴨和10日齡SPF雞胚均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

病毒核酸提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司；用于PCR擴增的EasyTagDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司；測序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1購自美國ABI公司。

1.2 病毒全基因組測序及遺傳演化分析 按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取3株H7N2亞型AIV的病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，按照Hoffmann等的引物及反應(yīng)條件分別對各目的基因節(jié)段進行PCR擴增[6]。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后測序鑒定。測序結(jié)果利用DNAStar軟件包中的Seqman進行序列拼接。利用MEGA 6.0中的Clustal W法進行病毒基因序列比對，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建HA及NA基因進化樹，Bootstrap值為1000。

1.3 病毒的純化及雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定將分離到的3株病毒10倍倍比稀釋后接種10日齡SPF雞胚，48 h后，收集最高稀釋度、最高血凝價的雞胚尿囊液，按照上述操作步驟，連續(xù)純化3代后，將尿囊液分裝凍存于-80℃?zhèn)溆?。純化保存的病?0倍倍比稀釋后分別接種5枚10日齡的SPF雞胚，48 h后，統(tǒng)計各稀釋度有血凝活性雞胚的數(shù)量，根據(jù)Reed-Muench法計算各株病毒EID50。

1.4 家禽感染性試驗 將106EID50/0.1 mL分離的3株H7N2 AIV分別經(jīng)鼻腔各接種11只6周齡SPF雞和各接種8只3周齡的SPF鴨，均是0.1 mL/只。感染3 d后，隨機迫殺3只感染的雞、鴨。分別取其腦、喉氣管、肺臟、胸腺、脾臟、胰腺、腎臟、盲腸扁桃體、法氏囊、心臟、肝臟，其余8只雞和5只鴨在感染后第3 d、5 d、7 d分別采集其咽喉拭子和泄殖腔拭子。采集的臟器加入1 mL含三抗(青霉素、鏈霉素、頭孢)的冰PBS液中研磨、離心后取上清，拭子常規(guī)處理后，利用雞胚進行臟器和拭子的病毒滴定，檢測各臟器中病毒的復(fù)制及排毒情況，并根據(jù)Reed-Muench法計算病毒滴度。每天觀察感染組雞、鴨是否出現(xiàn)明顯可見的臨床癥狀至感染后14 d，對存活的雞、鴨采血并分離血清，檢測血清HI抗體效價。

1.5 小鼠感染性試驗 以106EID50/50 μL的劑量經(jīng)鼻腔感染8只6周齡雌性BALB/c小鼠，50 μL/只。感染3 d后，隨機迫殺3只小鼠，取其腦、鼻甲、脾臟、腎臟、肺臟，通過雞胚滴定各臟器中的病毒，并根據(jù)Reed-Muench法計算病毒滴度，檢測病毒在小鼠體內(nèi)各臟器的復(fù)制；收集滴定臟器后HA效價較高的尿囊液進行病毒核酸提取、PCR擴增及測序，以檢測病毒的突變情況，剩余的5只小鼠，每天記錄體質(zhì)量變化至感染后14 d，并觀察其臨床癥狀。

2 結(jié)果

2.1 鴨源H7N2亞型AIV的遺傳演化分析及EID50測定結(jié)果 對3株鴨源H7N2亞型AIV各目的基因節(jié)段PCR擴增后拼接得到全基因組，對其序列進行比對分析。結(jié)果顯示，按照95%的核苷酸同源性劃分，3株H7N2亞型AIV的HA基因可以劃分為2個Group，其之間的同源性為89.2%～98.2%，且3株H7N2亞型AIV與2013年的H7N9亞型AIV不屬于同一分支(圖1)，表明3株鴨源H7N2亞型AIV與2013年的H7N9亞型AIV親緣關(guān)系較遠。分離株DK/HuN/S1515/2014和 DK/HuN/SD038/2015位于Group 2，屬于同一分支且二者同源性為98.2%，表明這兩株AIV高度同源，但與分離株DK/ZJ/S3192/2012同源性較低，親緣關(guān)系較遠。3株H7N2亞型AIV的NA基因同源性為83.1%～89.1%，分別位于3個不同的分支(圖2)，表明這3株AIV的NA基因親緣關(guān)系較遠。BLAST分析顯示，3株AIV的內(nèi)部基因來源復(fù)雜，與3株分離病毒核苷酸同源性最高的病毒株查找顯示，DK/ZJ/S3192/2012株的PB1、HA和M基因序列與數(shù)據(jù)庫中A/duck/Zhejiang/S3158/2012(H7N7)株的相應(yīng)核苷酸序列同源性最高，表明該病毒與后者親緣關(guān)系密切。DK/HuN/SD038/2015株的PB2與HA基因序列與A/duck/Fujian/S4170/2014(H7N9)病毒株的相應(yīng)核苷酸序列同源性最高，表明這兩株病毒親緣性更近。但DK/HuN/S1515/2014株病毒的8個基因節(jié)段序列均與不同亞型病毒相應(yīng)基因序列具有較高的相似度(表1)，表明該病毒基因來源多樣，且3株病毒均是H7N7、H3N8和H10N7等多個亞型AIV的重組體，表明不同來源分離病毒具有明顯的基因多樣性，可分為3個基因型，DK/ZJ/S3192/2012、DK/HuN/S1515/2014和DK/HuN/SD038/2015株AIV分別為基因A、B、C型。

根據(jù)Reed-Muench法計算病毒株DK/ZJ/S3192/2012、DK/HuN/S1515/2014和DK/HuN/SD038/2015的EID50分別為108.5EID50/0.1 mL、107.63EID50/0.1 mL、107.68EID50/0.1 mL。

2.2 分離病毒對雞的感染性試驗結(jié)果 利用3株H7N2亞型AIV進行SPF雞感染性試驗，感染組8只雞在兩周內(nèi)均存活。觀察期內(nèi)也無明顯肉眼可見的臨床癥狀。排毒試驗及各臟器病毒滴定結(jié)果顯示，在感染后第3 d、5 d、7 d感染雞的喉頭排毒雞數(shù)量明顯高于泄殖腔排毒雞數(shù)量(表2，5 d、7 d數(shù)據(jù)未顯示)，其中感染DK/ZJ/S3192/2012分離株的3只雞均能夠從胰腺中檢測到病毒，但其中1只雞還可以從肺臟、心臟、脾臟及腎臟中檢測到病毒，而其余臟器均未檢測到該病毒；其余兩株病毒均未在雞各臟器中檢測到(表2)，表明DK/HuN/S1515/2014與DK/HuN/SD038/2015株病毒均不能在雞臟器內(nèi)有效復(fù)制，且該3株鴨源性H7N2 AIV在雞體內(nèi)僅具有有限的復(fù)制能力。感染14 d后存活的雞血清抗體檢測結(jié)果顯示，其血清HI抗體幾乎全部轉(zhuǎn)陽，效價為在2～64。表明，該3株病毒均能夠誘導(dǎo)雞產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答。

圖1 分離病毒HA基因進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of HA gene

圖2 分離病毒NA基因進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of NA gene

表1 H7N2亞型AIV各基因節(jié)段同源性分析結(jié)果Table 1 Homology analysis of each segment of H7N2 avian influenza viruses

2.3 分離病毒對鴨的感染性試驗結(jié)果 利用3株H7N2亞型AIV進行SPF鴨感染性試驗，結(jié)果顯示，感染組5只鴨14 d觀察期內(nèi)全部存活且未出現(xiàn)任何明顯的臨床癥狀。排毒試驗結(jié)果顯示，3株病毒在所有感染的鴨中均可以通過喉頭和泄殖腔排毒。各臟器病毒滴定結(jié)果顯示，病毒在鴨消化道的復(fù)制能力要高于其在呼吸道的復(fù)制能力，并且3株病毒在鴨各臟器中的復(fù)制情況表現(xiàn)出明顯差異，其中DK/ZJ/S3192/2012于感染后3 d在感染鴨的肺、脾、腎、胰腺中檢測到病毒；DK/HuN/S1515/2014在感染鴨的肺、心臟、腎、胰腺中檢測到病毒；而DK/HuN/SD038/2015僅在感染鴨的脾、腎、胰腺中檢測到了病毒。這些結(jié)果表明3株H7N2亞型AIV在SPF鴨體內(nèi)復(fù)制良好。感染14 d后存活的鴨血清抗體檢測結(jié)果顯示，血清HI抗體全部轉(zhuǎn)陽且效價為4～32(表3)。表明，該3株病毒均能夠誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答。

2.4 分離病毒對BALB/c小鼠的致病性試驗結(jié)果將3株鴨源H7N2 AIV以106EID50/50 μL的劑量感染小鼠。臟器病毒滴定結(jié)果顯示，3株病毒在小鼠肺臟及鼻甲中的平均含量分別為4.9 log10 EID50/mL～6.6 log10 EID50/mL和4.5 log10 EID50/mL～5.2 log10 EID50/mL，但感染DK/HuN/S1515/2014株病毒的3只小鼠中僅1只在其腦組織中檢測到病毒，其余兩株病毒均未在小鼠的腦組織中檢測到(表4)，以上結(jié)果表明DK/HuN/S1515/2014株病毒可以突破小鼠血腦屏障在其腦內(nèi)增殖，同時3株H7N2亞型AIV均具有感染哺乳動物的能力。從感染小鼠臟器中重新分離到的病毒測序結(jié)果顯示未見其有任何突變，表明3株H7N2亞型AIV基因組在動物體內(nèi)復(fù)制的過程中未發(fā)生變化。小鼠體質(zhì)量在14 d觀察期內(nèi)變化不明顯，僅處于小幅度的波動范圍，表明3株病毒對小鼠呈現(xiàn)低致病力。

表2 H7N2亞型AIV對雞的致病力試驗結(jié)果Table 2 Replication and virulence of H7N2 avian influenza viruses in chicken.

表3 H7N2亞型AIV對鴨的致病力試驗結(jié)果Table 3 Replication and virulence of H7N2 avian influenza viruses in duck

表4 H7N2亞型AIV對小鼠的致病力檢測結(jié)果Table 4 Replication and virulence of H7N2 avian influenza viruses in mice

3 討論

盡管之前本研究室2014年從國內(nèi)分離到的H7N2 AIV的HA及多個內(nèi)部基因節(jié)段均來自2013年新出現(xiàn)的H7N9亞型AIV[4]，但在2014年之后，本研究室在監(jiān)測過程中再未發(fā)現(xiàn)這樣的重組病毒。本研究中3株H7N2亞型AIV均分離自活禽市場中的鴨，但其各基因節(jié)段來源均不同，為H7N7、H3N8和H10N7等多個亞型病毒的重組體，表明H7N2亞型AIV基因來源的復(fù)雜性及遺傳的多樣性。HA蛋白Q226L、G228S的突變能增強病毒結(jié)合人型受體的能力，從而引起人流感的大流行[7-8]。另外，HA蛋白裂解位點處多個堿性氨基酸的增加以及PB2蛋白E627K、D701N的突變均可以增強AIV對家禽及哺乳動物的致病力[9-10]。本研究通過對3株AIV相應(yīng)蛋白氨基酸關(guān)鍵位點的分析并未發(fā)現(xiàn)上述的突變出現(xiàn)(該部分數(shù)據(jù)未顯示)。

研究表明，2018年初分離到的一株高致病性A/duck/Fujian/SE0195/2018(H7N2)突變株，其HA基因來自高致病性H7N9亞型AIV，NA基因與H3N2亞型AIV高度同源，家禽感染性試驗結(jié)果顯示該病毒對感染家禽快速致死[5]，表明自然界存在發(fā)生基因重組并突變成高致病性病毒的風(fēng)險。雖然本研究中3株H7N2 AIV對家禽表現(xiàn)出低致病性，但仍存在病毒在其部分臟器中復(fù)制的情況，因此該病毒可以在家禽中復(fù)制和傳播，特別是在水禽中長期傳播。應(yīng)繼續(xù)加強對H7N2亞型AIV的監(jiān)測工作，必要時采取嚴(yán)格的防控措施。

PB2蛋白E627K和D701N的突變是影響流感病毒致病力的關(guān)鍵因素之一。2013年部分H7N9亞型人流感病毒PB2蛋白具有627K變異且該病毒可以在哺乳動物體內(nèi)有效復(fù)制，導(dǎo)致其出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀[10]。而且有研究報道，2017年的H7N9亞型AIV其PB2蛋白在哺乳動物體內(nèi)出現(xiàn)E627K、D701N的突變使病毒毒力增加萬倍以上[11]。在本研究中，分離的3株H7N2亞型AIV的PB2蛋白627和701位均未出現(xiàn)與哺乳動物適應(yīng)性相關(guān)的變異，但病毒能夠在小鼠體內(nèi)有效復(fù)制并導(dǎo)致其體質(zhì)量下降。這一結(jié)果表明H7N2 AIV也可能感染人類并導(dǎo)致疾病，值得關(guān)注。

因此，本研究對H7N2亞型AIV的持續(xù)監(jiān)測和生物學(xué)特性的深入研究可為我國流感疫情防控及預(yù)警預(yù)報提供有效的數(shù)據(jù)支持。