雙參通脈顆粒對大鼠心肌細胞凋亡的干預作用

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細胞凋亡作為細胞死亡的兩種表現(xiàn)形式之一，又稱為程序性細胞死亡，近年來大量研究表明急性心肌缺血后的心肌細胞中存在細胞凋亡[1]。P-JAK2在多種細胞外信號刺激下激活，激活的 JAK使 STAT3 磷酸化而被活化，移位到細胞核中，啟動相應基因表達，抑制細胞凋亡[2]。中藥雙參通脈顆粒具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡的功效。本研究采用雙參通脈顆粒干預大鼠急性心肌缺血模型，從而探討其對心肌細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠共60只，250～280 g。來源于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，于清潔級環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng) 7 d。

1.1.2 實驗藥物 雙參通脈顆粒，主要組成：人參、黃芪、麥冬、當歸、丹參、川芎，采用傳統(tǒng)顆粒制備方法，由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室提供。鹽酸地爾硫卓片由天津田邊制藥有限公司生產(chǎn)，每片30 mg，國藥準字：H12020126。

1.1.3 主要試劑與儀器 原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGA702)；DAB Kit(福州邁新生物科技有限公司 DAB-1031)；蘇木素染色液(南京建成生物工程研究所 D005)；4%多聚甲醛、蛋白酶 K、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(上海前塵生物科技公司)等。

高速臺式離心機(德國Eppdendorf 公司)；MP150 多導生理信號采集系統(tǒng)(德國 Leica 公司)；BB23 型培養(yǎng)箱(美國 PE 公司)；ROTEAN 電泳系統(tǒng)(美國 Bio 公司)；冰凍切片機OM3123 型(瑞典 Bio 公司)；恒溫恒濕箱(上海科技生物公司)；多功能酶標儀(美國 Cell Signaling 公司)等。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 對實驗動物進行造模，復制急性心肌缺血模型。取大鼠稱重，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，于腹腔麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于手術臺上，氣管切開，呼吸機輔助呼吸(頻率 85 次/min，潮氣量 18 mL，呼吸比1∶1)，連接心電檢測儀，術中記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于左冠狀動脈前降支起始下2 mm處結扎，正常組不結扎，檢查無出血，抽出胸腔積氣積液，拔出引流管，逐層關閉胸腔。

1.2.2 實驗分組及給藥方法 健康SD大鼠共60只，隨機分為6組：假手術組、模型組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，造模死亡率為20%，故剩余48例，每組8只。按人和動物等效劑量換算法折算大鼠劑量進行換算，正常組及模型組予生理鹽水3 mL灌胃，每日2 次；西藥組予以鹽酸地爾硫卓片灌胃，劑量為4.23 mg/kg；中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組予雙參通脈顆粒灌胃，分別相當于生藥量37.5g/(kg·d)、18.75g/(kg·d)、 9.37 g/(kg·d)，均制成 6 mL，每次3 mL，每日2 次，療程2周。

1.2.3 觀察心肌組織病理變化 取連續(xù)心肌組織2塊，厚度2～3 mm，將標本固定于4%多聚甲醛中，觀察各級乙醇脫水，石蠟固定進行常規(guī)切片，按常規(guī)方法進行脫蠟，水合，再于二甲苯、各級乙醇中脫水，抗原修復，抗原-抗體反應，蘇木精-伊紅(HE)復染，二甲苯透明、濾紙吸干、中性樹膠封片，光鏡下觀察左心室組織學改變。

1.2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 取心肌組織石蠟包埋、切片、脫水、蛋白酶孵育，加入 TUNEL 反應液，于37 ℃下靜置 1 h，加 DAB 蘇木素復染，PBS洗滌，梯度酒精脫水，二甲苯透明、封片。顯微鏡下正常心肌細胞核藍色，凋亡細胞核為棕褐色。每張切片于相同區(qū)域選取5個高倍視野計數(shù)，其中所占總細胞數(shù)百分比即為凋亡指數(shù)。

1.2.5 P-JAK2蛋白表達 取缺血心肌組織數(shù)塊，提取蛋白，進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳。采用Western Blot方法測定心肌細胞中的P-JAK2蛋白表達。

2 結 果

2.1 心肌組織病理變化 假手術組：心肌細胞排列緊密，無明顯水腫，肌纖維未見明顯扭曲，細胞膜完整，細胞核居中，無明顯炎癥浸潤；模型組：心肌細胞水腫，組織間隙增寬，肌纖維扭曲、紊亂，炎細胞浸潤，大量紅細胞存在于細胞間隙，細胞核散亂分布；西藥組：與模型組比較，心肌細胞水腫明顯好轉，肌纖維斷裂現(xiàn)象較少，炎細胞浸潤，紅細胞滲出；中藥低劑量組：與模型組比較，心肌細胞水腫減輕，細胞邊界清晰，存在出血，紅細胞滲出較多；中藥中劑量組：心肌細胞排列尚規(guī)整，與模型組比較，心肌細胞水腫區(qū)域較小，肌纖維無明顯斷裂，炎癥浸潤不明顯；中藥高劑量組：與模型組比較，心肌細胞水腫顯著減輕，細胞邊界輪廓清晰，組織間隙有輕微水腫，肌纖維無斷裂，紅細胞滲出較少。詳見圖1。

2.2 心肌細胞凋亡 心肌細胞凋亡指數(shù)：假手術組心肌組織未見明顯凋亡的細胞；模型組心肌組織中凋亡細胞較多、較密集；西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組凋亡細胞均較模型組減少。詳見圖2。

2.3 各種心肌細胞中P-JAK2蛋白表達 與假手術組比較，模型組P-JAK2蛋白表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組P-JAK2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，西藥組、中藥中劑量組P-JAK2表達有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中藥高劑量組與西藥組、中藥低劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖 3。

3 討 論

中藥雙參通脈顆粒由人參、黃芪、麥冬、當歸、丹參、川芎6味藥物組成，方中人參大補元氣，黃芪補氣健脾，麥冬益胃生津，當歸活血養(yǎng)血，丹參活血止痛，川芎行氣活血，全方通補兼施，共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參所含有的總皂甙可以抑制細胞凋亡，其作用機制可涉及多個細胞信號傳導通路[3]。黃芪具有增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈、保護心肌細胞、改善心臟功能等作用[4]。麥冬提取物及皂苷等成分，具有抗心肌缺血、保護心肌、抗炎等作用[5]。當歸所含有機酸有抗心肌缺血、保護線粒體等作用[6]。丹參具有抗動脈粥樣硬化、保護血管內(nèi)皮細胞、改善微循環(huán)等作用[7]。川芎主要成分川芎嗪，具有血管平滑肌解痙作用，并能保護線粒體，對心血管系統(tǒng)有強大活性[8]。雙參通脈顆粒諸藥合用，能夠抗心肌缺血、減輕心肌細胞氧化損傷，隨著中醫(yī)藥研究的不斷深入，其干預心肌細胞凋亡的機制將被進一步闡明。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，作為細胞死亡形式的一種，目前研究表明，缺血損傷可激活 JAK2/STAT3 信號通路，減少P-JAK2和P-STAT3的表達，誘發(fā)心肌細胞凋亡[9]。P-JAK2作為細胞凋亡的抑制因子，能降低心肌細胞凋亡，減輕氧化損傷[10]。而使用 JAK2 特異性阻斷劑 AG490，能取消該通路的心肌保護作用[11]。有學者發(fā)現(xiàn)，姜黃素等藥物預處理誘導大鼠的心肌保護作用，均通過誘導心肌 JAK2和STAT3 的磷酸化，減少心肌梗死面積和心肌細胞凋亡[12]。本研究通過測定P-JAK2蛋白表達來觀察中藥雙參通脈顆粒對心肌細胞凋亡的影響。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化(HE 染色，光鏡 ×200)

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡(HE 染色，光鏡 ×200)

與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05
圖3 Western Blot檢測各組P-JAK2蛋白表達

本實驗結果表明，與假手術組比較，各組P-JAK2 表達均降低，說明急性心肌缺血大鼠存在心肌細胞凋亡。與模型組比較，各組P-JAK2表達均升高，中藥低劑量組P-JAK2表達明顯升高，說明雙參通脈顆粒高劑量能夠通過上調(diào)P-JAK2表達，來減輕心肌炎癥反應，降低心肌細胞凋亡。

綜上所述，中藥雙參通脈顆粒能夠減輕心肌炎癥反應，降低心肌細胞凋亡，減輕氧化損傷，其機制可能與上調(diào)P-JAK2表達有關。隨著中醫(yī)藥研究的不斷深入，將對中藥干預心肌細胞凋亡提供新的思路。