替米沙坦對(duì)ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響

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盡管在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的預(yù)防和治療方面取得了很大的進(jìn)展，但仍有很高比例的病人在急性冠狀動(dòng)脈事件中突然死亡[1]。研究表明，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂和隨后的血栓形成占急性冠狀動(dòng)脈事件的70%。易于破裂的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊被稱為易損斑塊[2]，因此，穩(wěn)定易損斑塊是冠心病治療的重點(diǎn)。臨床研究顯示，不管是通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類或是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)都可以減少冠心病病人的發(fā)病率和死亡率[3]。并且實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，ACEI類或是ARB類藥物都可以抑制動(dòng)脈硬化病變[4]。但其是否可以穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，相關(guān)研究有限。因此，本研究的目的是確定替米沙坦是否具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6～8周齡載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠[品系C57BL/6J，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)并培育)]32只，雌雄各半，體重18～20 g。

1.1.2 藥物及配制 替米沙坦商品名美卡素，由上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為J20090089。阿托伐他汀商品名立普妥，由輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為H20051409。

1.1.3 試劑與儀器 抗鼠平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白(SMα-actin)購(gòu)自Neo Markers公司。二步法免疫組化檢測(cè)試劑(鼠兔共用通用型二抗)購(gòu)自DaKo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立、分組及給藥 基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)6～8周后，給小鼠飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料[5](60Coγ滅菌照射處理)13周。確定AS形成后，將小鼠隨機(jī)分為3組：替米沙坦組、阿托伐他汀組、對(duì)照組，各10只。按成人與小鼠的給藥劑量換算系數(shù)折算成小鼠用量[6]：替米沙坦組12.01 mg/(kg·d)，阿托伐他汀組3 mg/(kg·d)，對(duì)照組(蒸餾水)。將藥物溶于蒸餾水中，灌胃給藥，每日1次，繼續(xù)喂養(yǎng)13周。

1.2.2 標(biāo)本處理 給藥治療13周后處死全部小鼠，游離主動(dòng)脈，沿中線縱向切開(kāi)用于觀察大體病理標(biāo)本，大體標(biāo)本進(jìn)行蘇丹Ⅳ染色。取出心臟，10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，小鼠心底部橫斷面連續(xù)切片。按Suzuki等[7]的方法，每只小鼠主動(dòng)脈根部取3個(gè)相同的切面，分別是：①升主動(dòng)脈最近端橫截面；②主動(dòng)脈瓣起始橫截面；③主動(dòng)脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起。每只小鼠各取上述3個(gè)切面的切片分別進(jìn)行HE染色、Movat染色和免疫組化染色，光鏡下觀察。每個(gè)樣本的所用形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)的計(jì)算均取3個(gè)切面的平均值進(jìn)行較全面的綜合評(píng)價(jià)。

1.2.3 病理染色

1.2.3.1 HE染色 HE染色主要觀察斑塊內(nèi)細(xì)胞外脂質(zhì)(extracellular lipids，EL)成分(主要是膽固醇結(jié)晶和膽固醇酯)。

1.2.3.2 Movat五色套染法 采用改良的Movat五色套染法[8]，染色結(jié)果為：細(xì)胞核及彈力纖維為黑色；基質(zhì)和黏蛋白為藍(lán)色；膠原纖維為黃色；平滑肌為紅色；泡沫細(xì)胞(foam cells，F(xiàn)C)為淡紫色。主要觀察斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞、膠原成分。

1.2.3.3 免疫組化染色 免疫組化染色檢測(cè)主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)SMα-actin。采用Envision兩步法免疫組化染色，切片脫蠟，0.3%H2O2室溫15 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加一抗(1∶300稀釋)4 ℃過(guò)夜；滴加通用型二抗，室溫孵育1～2 h；TAB顯色。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.4.1 大體標(biāo)本 將染色后的大體標(biāo)本在放大6倍的體視顯微鏡下拍照，并使用圖像分析軟件(Image-ProPlus 5.1)測(cè)量血管內(nèi)膜上的斑塊面積和內(nèi)膜總面積，并計(jì)算斑塊/內(nèi)膜面積的比值。

1.2.4.2 主動(dòng)脈根部橫切片 切片在×40倍普通光鏡下，利用病理組織實(shí)時(shí)攝像顯微鏡系統(tǒng)攝像。采用圖像分析軟件測(cè)量每個(gè)切片的管腔面積和內(nèi)彈力膜圍繞面積，后者減去前者即為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積。校正后斑塊面積即斑塊面積除以內(nèi)彈力膜圍繞面積。同時(shí)采用該軟件測(cè)量并計(jì)算細(xì)胞外脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞、膠原面積(collagen area，CA)成分各自占斑塊面積的百分比，并結(jié)合免疫組化染色測(cè)量斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞(SMC)陽(yáng)性面積占斑塊面積的百分比，最后采用易損指數(shù)(vulnerablility index，VI)[9]綜合評(píng)價(jià)藥物對(duì)小鼠主動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的影響。每個(gè)樣本取3個(gè)切面的平均值。計(jì)算公式為：VI=(EL+FC)/(CA+SMC)，每個(gè)樣本取上述指定的3個(gè)切面的平均值。

1.2.4.3 血脂測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采血，采血前12 h禁食水，眶下靜脈取血，離心分離血清。總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride， TG)用酶法測(cè)定，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)用免疫比濁法測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 病理觀察

2.1.1 大體標(biāo)本 各組小鼠主動(dòng)脈管壁均明顯增厚、粗糙，管壁上可見(jiàn)一些紅染呈斑塊樣突起，大小不等，散在或融合成片，詳見(jiàn)圖1。干預(yù)后，替米沙坦組及阿托伐他汀組小鼠主動(dòng)脈斑塊/內(nèi)膜面積比值分別為28%、22%，均明顯低于對(duì)照組的36%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后粥樣硬化病變累及范圍有所降低；但替米沙坦組和阿托伐他汀組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖1 ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈大體標(biāo)本(蘇丹Ⅵ染色)

與對(duì)照組比較，＊ P<0.05圖2 各組ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈大體標(biāo)本斑塊面積的比較

2.1.2 HE染色和Movat五色套染法觀察斑塊內(nèi)部成分 如圖1、圖3～圖6所示，光鏡下對(duì)照組及各藥物干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈根部可見(jiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，顯示出易損斑塊特征。Movat五色套染法染色后，光鏡下模型組及各藥物干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈根部?jī)?nèi)皮細(xì)胞下可見(jiàn)淡紫色泡沫細(xì)胞，斑塊纖維帽被泡沫細(xì)胞覆蓋，彈力纖維變性、斷裂、變薄、甚至消失，血管三層結(jié)構(gòu)破壞。對(duì)于主動(dòng)脈根部橫切面動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，替米沙坦組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，阿托伐他汀組較對(duì)照組減少了23%(P<0.05)，但校正后斑塊面積各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖7、圖8。

圖3 ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈根部橫切面HE染色(×10)

圖4 ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈根部橫切面HE染色(×40)

圖5 ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈根部橫切面Movat染色(×40)

圖6 ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈根部橫切面平滑肌免疫組化染色(×40)

與對(duì)照組比較，＊ P<0.05圖7 各組ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈根部橫切面斑塊面積比較

圖8 各組ApoE基因敲除小鼠校正后主動(dòng)脈根部橫切面斑塊面積比較

2.2 主動(dòng)脈斑塊內(nèi)部成分改善情況 給藥13周后，替米沙坦組和阿托伐他汀組小鼠動(dòng)脈斑塊易損指數(shù)分別為1.12和0.91，均低于對(duì)照組的2.67(P<0.05)。

詳見(jiàn)圖9、圖10。

與對(duì)照組比較，＊P<0.05，#P<0.01圖9 各組ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈斑塊成分所占面積比較

與對(duì)照組比較，＊P<0.05圖10 各組ApoE基因敲除小鼠易損指數(shù)比較

2.3 血脂的測(cè)定 與對(duì)照組比較，阿托伐他汀組TC和LDL-C水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組ApoE基因敲除小鼠血脂水平比較(±s) mmol/L

與對(duì)照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

一些臨床研究顯示，ARB或ACEI類藥物不僅能夠降低血壓，同時(shí)能夠減少病人心血管事件，并且與藥物本身的降壓作用無(wú)關(guān)[10-12]。這是因?yàn)镽AS系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展中起著重要作用，因此ARB類藥物作為抗動(dòng)脈粥樣硬化藥得到了廣泛應(yīng)用[13-14]。目前的研究表明，斑塊的穩(wěn)定性主要取決于斑塊內(nèi)組織成分以及纖維帽的狀態(tài)[14]。纖維帽主要是由平滑肌細(xì)胞和膠原構(gòu)成[14]。而巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和γ-干擾素，最終使斑塊纖維帽變薄，易于破裂[15]。因此，將脂質(zhì)成分(泡沫細(xì)胞和細(xì)胞外脂質(zhì))與纖維肌性成分(平滑肌細(xì)胞和膠原纖維)共同作為衡量斑塊的易損指數(shù)[9]，可作為反映斑塊易損性的更為客觀、全面的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，替米沙坦組及阿托伐他汀組小鼠主動(dòng)脈斑塊易損指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。替米沙坦組可降低泡沫細(xì)胞含量，增加膠原和平滑肌，使得易損指數(shù)下降。阿托伐他汀組可降低細(xì)胞外脂質(zhì)，增加膠原和平滑肌，也使易損指數(shù)下降。因此，替米沙坦和阿托伐他汀都可以穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，替米沙坦對(duì)血脂水平和細(xì)胞外脂質(zhì)面積的影響并不顯著，但可以明顯減少泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞來(lái)源于巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞低密度脂蛋白轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。研究顯示巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的所有階段都具有重要功能，包括斑塊破裂的過(guò)程。因此，推測(cè)替米沙坦促進(jìn)斑塊穩(wěn)定性的可能機(jī)制是抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞。這與目前的研究結(jié)果相一致，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活后血管緊張素作用于血管壁AT1受體從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，在動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)AT1受體表達(dá)增多并通過(guò)單核細(xì)胞趨化蛋白促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞聚集，還可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞移行和增殖而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[16]。而替米沙坦作為一種高選擇性AT1受體拮抗劑，可減少單核/巨噬細(xì)胞的聚集，提示其在延緩或穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊方面有重要作用。

綜上所述，本研究表明，使用替米沙坦可以有效地延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，并通過(guò)改變斑塊的組成促進(jìn)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，深入研究替米沙坦穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步提高穩(wěn)定斑塊作用，減少臨床急性心血管事件的發(fā)生具有重要意義。