基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討芎芍膠囊抗動脈粥樣硬化的作用機制

， ， ，鳳芹

活血化瘀是中醫(yī)治療動脈粥樣硬化(AS)的有效治法，針對炎癥反應(yīng)的“毒”認識，解毒活血法治療動脈粥樣硬化易損斑塊療效確切[1]。國家“八五”攻關(guān)期間，實驗和臨床研究均證明活血化瘀藥血府逐瘀濃縮丸有明確抗動脈粥樣硬化療效，其后逐漸精簡選擇方中兩味主藥川芎、赤芍，臨床研究顯示在西藥常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用芎芍膠囊，對經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術(shù)后再狹窄可以起到較好的防治作用[2]。方中川芎辛溫而燥，善于行走，能化瘀滯，開血郁，上行頭目，下達血海，為血中氣藥；赤芍通利血脈，其性偏涼，可制川芎溫燥之性。川芎與赤芍，性雖有寒熱之殊，而功有行血破滯之同，兩藥合用可發(fā)揮協(xié)同作用，使機體氣血運行正常，營衛(wèi)生化有度。實驗研究發(fā)現(xiàn)其能夠抗血小板黏附聚集，降脂，抑制平滑肌細胞增殖，預(yù)防血管重構(gòu)從而延緩動脈粥樣硬化進展[3-5]。在“活血化瘀藥(芎芍膠囊)促進動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運的機制研究”(國家自然科學(xué)基金，編號81173385)中發(fā)現(xiàn)活血化瘀藥(芎芍膠囊)在不影響脂蛋白水平的情況下能夠促進膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運，升高協(xié)同其他相關(guān)蛋白參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT)全過程的肝X受體蛋白表達量，促進膽固醇轉(zhuǎn)出，降低髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)水平，抗動脈粥樣硬化作用確切，但其分子機制尚不清楚。

BATMAN-TCM分析體系基于TCMID數(shù)據(jù)庫中藥方-草藥-組成化學(xué)物的關(guān)系，其中包括了46 914個藥方、8 159種草藥以及25 210個化合物(scientific reports)[6]。本研究利用BATMAN-TCM平臺獲取芎芍膠囊各組分對應(yīng)的靶標基因，進行靶點預(yù)測、藥靶功能分析及中藥成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)的可視化呈現(xiàn)，以嘗試揭示芎芍膠囊防治動脈粥樣硬化的分子作用機制。

1 資料與方法

1.1 預(yù)測靶標基因 將芎芍膠囊中川芎、赤芍分別導(dǎo)入BATMAN-TCM 平臺進行靶標基因預(yù)測及分析；而后通過計算“芎芍膠囊化合物—靶標”與“已知藥物—靶標”之間的相似性，并對潛在的藥物靶標相互作用進行打分(score)[7]，并以score≥20分的靶標作為潛在的靶標基因。

1.2 靶標基因富集分析 靶標分析功能基于功能條目的富集分析，考察中藥的潛在靶標可能具有的生物學(xué)功能及參與的生物學(xué)通路。靶標功能分析中涉及DrugBank (2015.7.26)、GO功能條目[8]，KEGG生物學(xué)通路[9](版本2014.7.31)以及OMIM/TTD[10](版本號4.3.02)疾病的富集分析是基于超幾何分布設(shè)計的算法，而多重檢驗校正則使用的是Benjamini-Hochberg校正方法[11]。如果靶標在這些條目上的超幾何分布檢驗校正后的P值小于設(shè)定卡值(本報告中設(shè)置P≤0.05)，可以認為靶標在這些條目上富集。同時給出這些靶蛋白顯著富集的KEGG生物學(xué)通路、GO功能注釋條目(包括生物學(xué)過程、分子功能和細胞定位三大類)、OMIOM/TTD疾病通路，以及統(tǒng)計檢驗的P值、條目相關(guān)的基因數(shù)量和基因列表等信息。這些顯著富集的KEGG生物學(xué)通路和GO功能條目可能在中醫(yī)藥療效的發(fā)揮中扮演了重要的角色，為中藥分子作用機制的實驗驗證提供線索。

1.3 分析與動脈粥樣硬化相關(guān)的靶標基因與通路 為了能夠探索不同組分潛在的作用機制，本研究將化合物與他們的潛在靶標、相關(guān)疾病和通路關(guān)聯(lián)，構(gòu)建“組成化合物-靶標-生物學(xué)通路-疾病”的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，使用cytoscape 3.2.0繪制關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，將化合物、靶標、生物學(xué)通路及疾病以不同顏色和形狀的節(jié)點來表示。

2 結(jié) 果

2.1 芎芍膠囊的潛在靶標基因 通過BATMAN-TCM 平臺檢索芎芍膠囊所含化合物有110種，如川芎中的川芎嗪、藁本內(nèi)酯、阿魏酸等，赤芍中的芍藥苷、沒食子酸、兒茶素等。以化合物在BATMAN-TCM平臺獲取的靶標基因，score≥20 分的靶標基因共有965個，現(xiàn)列出預(yù)測的15個潛在的藥物靶標基因。在 UniProt 數(shù)據(jù)庫中檢索這些基因?qū)?yīng)的蛋白，包括與脂代謝相關(guān)的過氧化物酶體增殖物激活受體δ(PPARD)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)，與調(diào)節(jié)膽固醇攝取相關(guān)的核受體NR1H3、NR1H2，與脂質(zhì)運輸相關(guān)的微粒體甘油三酸酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTTP)等。詳見表1。

2.2 靶標基因的富集分析

2.2.1 潛在的靶標分析之功能分布(GeneOntology) 利用2.3靶標分析方法，分析了其中965個潛在靶標分子(score≥20分)，發(fā)現(xiàn)在73個功能條目顯著富集(P≤0.05)，如Signal Transducer Activity、Lipid Metabolic Process等這些與信號傳導(dǎo)活性、脂質(zhì)代謝功能條目，部分顯著富集的功能條目詳見表2。

2.2.2 潛在的靶標基因的分析之KEGG通路分布及可視化呈現(xiàn) 該部分生物學(xué)通路的分析方法同上，分析了965個潛在靶標分子(score≥20分)的KEGG生物學(xué)通路的分布，發(fā)現(xiàn)這些靶標分子傾向在53個通路顯著富集(P≤0.05)，如脂肪酸代謝、講解相關(guān)通路及脂代謝相關(guān)的PPARγ信號通路。部分顯著富集的生物學(xué)通路詳見表3。

表1 芎芍膠囊部分靶標基因(≥20分)

表2 芎芍膠囊部分靶標基因功能分布

表3 芎芍膠囊部分靶標基因KEGG通路分布

(續(xù)表3)

通路ID通路描述P基因數(shù)量 基因hsa00020Citrate cycle (TCA cy-cle)2.23E0412SUCLA2;SUCLG1;SDHC;OGDHL;OGDH;DLST;SDHA;SDHD;SDHB;ACO2;SUCLG2;DLDhsa00640Propanoate metabolism9.77E0513SUCLA2;ALDH2;SUCLG1;EHHADH;ABAT;ALDH1B1;ACSS2;SU-CLG2;ACAT1;ALDH7A1;ACADM;ACSS1;ALDH9A1hsa00071Fatty acid degradation2.23E0415ADH1A;ADH7;ADH4;ALDH2;EHHADH;ACSL3;ALDH1B1;ADH1B;ADH1C;ACADSB;ACAT1;ALDH7A1;ACADM;ACSL4;AL-DH9A1hsa00072Synthesis and degrada-tion of ketone bodies4.55E024OXCT1;OXCT2;BDH1;ACAT1hsa03320PPAR signaling path-way1.83E0522RXRA;APOA2;FABP6;FABP2;ACSL4;PPARG;CD36;FABP3;EH-HADH;SCD5;SCD;NR1H3;ADIPOQ;FADS2;RXRG;ACSL3;PPARA;RXRB;PPARD;ACADM;APOA1;CYP27A1

生物學(xué)通路的可視化：針對靶標分析得到富集的KEGG生物學(xué)通路，呈現(xiàn)靶標、靶標相互作用對象以及他們與上下游分子的調(diào)控關(guān)系。潛在靶標在PPAR signaling pathway通路上的覆蓋情況詳見圖1。

注：紅色標注為預(yù)測靶標
圖1潛在靶標在PPARs信號通路的作用

2.2.3 潛在的靶標基因的分析之疾病分布(OMIM/TTD) 利用靶標分析方法，分別基于OMIM和TTD數(shù)據(jù)進行了965個潛在靶標分子(score ≥20分)的疾病富集分析，發(fā)現(xiàn)在5個OMIM以及25個TTD疾病條目顯著富集(P≤0.05)，如動脈粥樣硬化、冠心病、心律失常、心力衰竭等心臟相關(guān)疾病，糖尿病、代謝綜合征等代謝相關(guān)疾病，哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸相關(guān)疾病。部分顯著富集的疾病詳見表4。

表4 芎芍膠囊部分靶標基因顯著富集的疾病

2.2.4 與動脈粥樣硬化相關(guān)的潛在靶標-生物學(xué)通路/疾病的網(wǎng)絡(luò)可視化 將73個化合物與他們的679個潛在靶標、相關(guān)的疾病(79個OMIM和66個TTD)和167個通路關(guān)聯(lián)。同時針對那些顯著富集的通路、疾病條目構(gòu)建了關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)部分的TTD疾病分析結(jié)果，選取了與動脈粥樣硬化相關(guān)的13個靶標，構(gòu)建了草藥-化合物-潛在靶標-生物學(xué)通路/疾病的網(wǎng)絡(luò)。詳見表5、圖2。

表5 芎芍膠囊與動脈粥樣硬化相關(guān)靶標

圖2與動脈粥樣硬化相關(guān)的潛在靶標-生物學(xué)通路/疾病的網(wǎng)絡(luò)

在該關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中，包含了5種類型的節(jié)點。不同類型的結(jié)果分別使用不同的顏色和形狀來表示。其中綠色七邊形表示草藥墨，綠色菱形組成化合物，紅色圓形表示藥物的潛在靶標，紫色三角形表示KEGG生物學(xué)通路，淺棕色正方形表示OMIM收錄的疾病，棕色正方形表示TTD收錄的疾病?！敖M成化合物-靶標-生物學(xué)通路-疾病”的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中還包含了3種聯(lián)系(邊)，分別是化合物與靶標的聯(lián)系(如果這個靶標是TCM組成化合物的已知或潛在靶標)、靶標與通路的聯(lián)系(如果這些靶標在某生物學(xué)通路上富集)、靶標與OMIM/TTD疾病的聯(lián)系(如果這些靶標在該疾病條目富集)。靶標節(jié)點、生物學(xué)通路節(jié)點以及疾病節(jié)點的大小都會隨著他們在網(wǎng)絡(luò)中的連接度變化；連接度越大，節(jié)點越大。靶標節(jié)點的連接度由其相關(guān)的化合物數(shù)量決定。生物學(xué)通路節(jié)點的連接度由相關(guān)的靶標數(shù)量決定；同樣的，疾病條目節(jié)點的連接度也由相關(guān)的靶標數(shù)量決定。

3 討 論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測到芎芍膠囊的潛在靶標基因965個，在53條通路顯著富集，有13個靶標與動脈粥樣硬化相關(guān)，涉及炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)運輸與降解、糖脂代謝等過程，由圖2可知，組方藥物川芎、芍藥中的多個化合物共同作用于PPARD、ESR1，直接參與脂肪酸降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等脂質(zhì)代謝過程，與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死、肥胖、糖尿病等疾病相關(guān)，證實了芎芍膠囊中川芎、赤芍抗動脈粥樣硬化的協(xié)同作用，其中川芎還參與了炎癥反應(yīng)、糖脂代謝等過程。預(yù)測結(jié)果與芎芍膠囊前期臨床研究、實驗研究中防治PCI術(shù)后冠狀動脈再狹窄、促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運、抗炎相一致[2-4]，同時也為芎芍膠囊后續(xù)在抗動脈粥樣硬化研究領(lǐng)域提供了新的思路。此外，芎芍膠囊還參與了心律失常、心力衰竭、糖尿病、代謝綜合征、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等相關(guān)疾病。

本研究依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理，其實質(zhì)是通過與已知的藥物靶標的相互作用比較，進而計算相似性，并對潛在的藥物靶標相互作用進行打分推算而來，存在一定的局限性，如無法預(yù)測不同藥物組分的相互作用、無法量化藥物的藥理作用，而且不能預(yù)測尚未發(fā)現(xiàn)的抗動脈粥樣硬化機制。課題組將在后續(xù)的研究中對預(yù)測的靶標基因和通路進行驗證，深入探索芎芍膠囊抗動脈粥樣硬化機制。綜上可知，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)芎芍膠囊可能通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。