雷公藤甲素對內(nèi)毒血癥大鼠血管低反應(yīng)性的影響

宗佳琪，王爍陽，蘇 萍，郭馬娣，刁光華，王 靜，周萍萍，王海華

(1.皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

內(nèi)毒血癥是革蘭氏陰性菌侵入血液，并在其中大量繁殖、崩解后釋放出大量炎癥因子所致，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分。LPS可以刺激體內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生一系列的炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)。這些炎癥因子促使全身血管對縮血管物質(zhì)和舒血管物質(zhì)的反應(yīng)降低，即血管低反應(yīng)性，若不積極進(jìn)行治療，將發(fā)展成持續(xù)低血壓、致死性感染性休克、全身器官衰竭，最終導(dǎo)致死亡[1-2]。臨床上，通常采用抗生素和糖皮質(zhì)激素作為治療內(nèi)毒血癥的常規(guī)手段，但治療效果不佳[3-4]。因此，本研究旨在為治療內(nèi)毒血癥導(dǎo)致的血管低反應(yīng)性提供新的干預(yù)策略。雷公藤甲素(triptolide，TP)具有各種藥理活性，如抗炎、免疫抑制、抗菌作用，是從中藥雷公藤中提取出來的二萜類成分[5]。研究證實(shí)，TP通過減輕LPS刺激的Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等蛋白的表達(dá)，從而減輕小鼠急性肺損傷[6]。TP能改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病心肌病大鼠心臟的收縮功能和心肌能量代謝[7]。然而，TP是否能夠調(diào)節(jié)LPS內(nèi)毒血癥大鼠模型的胸主動脈血管張力仍不清楚。因此，通過復(fù)制內(nèi)毒血癥大鼠模型觀察TP對其血液流變性及血管張力的作用，從而為內(nèi)毒血癥的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑 TP(T819207，純度≥98%)：上海麥克林生化科技有限公司；LPS[L82749(026:B6)]、氯化乙酰膽堿(acetylcholine，ACh；純度≥99%)、去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe；純度≥98%)、左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME；純度≥99%)、亞甲藍(lán)(methylene blue，MB；純度≥99%)：美國Sigma公司；K-H液(NaCl 118.4 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，NaHCO324.5 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.1 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.55 mmol/L，C6H12O6·H2O 11.1 mmol/L)：國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 體外組織灌流裝置(PL3508B5/C-V)和Power Lab系統(tǒng)：澳大利亞埃德儀器公司。

2 方法

2.1 內(nèi)毒血癥大鼠模型復(fù)制 60只SD雄性大鼠，體質(zhì)量為(220±20)g，SPF級，購自安徽省合肥市蜀山實(shí)驗(yàn)動物繁殖中心[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(魯)2014-0007]，室溫24 ℃下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。用LPS 10 mg/kg腹腔注射復(fù)制內(nèi)毒血癥大鼠模型。內(nèi)毒血癥模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)：注射LPS 6 h后，動物沒有死亡，并表現(xiàn)出盤縮成團(tuán)、萎靡不振、腹瀉、活動力低下，伴有發(fā)紺、震顫以及血壓明顯下降。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為6組(n=6)：正常組(NC組)、內(nèi)毒血癥模型組(LPS組)、TP低濃度干預(yù)組(LPS+TP-L組)、TP中濃度干預(yù)組(LPS+TP-M組)、TP高濃度干預(yù)組(LPS+TP-H組)和多黏菌素B組(LPS+PMX-B組)。

TP用0.1% DMSO溶解，TP低劑量(25 μg/kg)、中劑量(50 μg/kg)、高劑量(100 μg/kg)干預(yù)組在復(fù)制內(nèi)毒血癥模型組前15 min進(jìn)行腹腔注射，LPS+PMX-B組(0.2 mg/kg)以尾靜脈注射。所有大鼠均隨機(jī)直接復(fù)制模型和給藥后進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)學(xué)校倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行。

2.3 大鼠平均動脈壓(mean arterial blood pressure，MABP)和血流動力學(xué)指標(biāo)測定 采用25%烏拉坦4 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠并固定，從大鼠右頸總動脈插管監(jiān)測MABP，繼而將插管插入心室，測量大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)：心率(heart rate，HR)、左室舒張壓(left ventricular diastolic pressure，LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(maximal rate of the increase/decrease of left ventricular pressure，±dp/dtmax)，待以上指標(biāo)穩(wěn)定后，記錄30 min數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4 胸主動脈環(huán)的制備 大鼠采血后，開胸迅速取出其胸腹段主動脈，置入4 ℃預(yù)冷的K-H液(pH 7.4)中。按照文獻(xiàn)[8]的方法將其分成3～4 mm的血管環(huán)4段，采用棉簽輕輕摩擦以去除內(nèi)皮，制備去內(nèi)皮血管環(huán)。通過PL3508B5/C-V體外組織灌流裝置和Power Lab系統(tǒng)記錄血管環(huán)張力變化，并檢測其內(nèi)皮完整性。內(nèi)皮完整的血管環(huán)記為E+，去內(nèi)皮的血管環(huán)記為E-。

2.5 血管環(huán)收縮和舒張功能的測定 累計(jì)加入10-8～10-5mol/L Phe刺激血管環(huán)(E+和E-)，觀察并記錄其對血管環(huán)收縮反應(yīng)的影響；用10-6mol/L Phe預(yù)收縮血管環(huán)(E+)，待其收縮達(dá)到平臺期后累計(jì)加入10-8～10-4mol/L ACh，觀察并記錄其對血管環(huán)舒張反應(yīng)的影響；分別用10-4mol/L的非特異性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑L-NAME或10-5mol/L的鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)抑制劑MB孵育血管環(huán)(E+)20 min，再累計(jì)加入10-8～10-5mol/L Phe刺激，觀察并記錄其對E+血管環(huán)收縮反應(yīng)的影響。整理數(shù)據(jù)，按以下公式計(jì)算血管收縮率和血管舒張率：血管舒張率=(Phe刺激后最大收縮張力-累加ACh后的張力)/(Phe刺激后最大收縮張力-基礎(chǔ)張力)×100%；血管收縮率=(累加Phe刺激后的收縮張力-基礎(chǔ)張力)/空白組收縮張力均值×100%。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠MABP比較 與NC組比較，LPS組大鼠MABP明顯降低(P<0.05)；LPS+TP-H組與PMX-B組大鼠MABP無明顯改變(P>0.05)；與LPS組比較，LPS+TP-M組、LPS+TP-H組與LPS+PMX-B組大鼠MABP均明顯升高(P<0.05)。見圖1。

注：A. NC組；B. LPS組；C. LPS+TP-L組；D. LPS+TP-M組；E. LPS+TP-H組；F. LPS+PMX-B組；與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠血流動力學(xué)比較 與NC組比較，LPS組大鼠HR、LVDP和±dp/dtmax均顯著降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+TP-L組、LPS+TP-M組、LPS+TP-H組和LPS+PMX-B組大鼠HR和±dp/dtmax均顯著升高(P<0.05)，LPS+TP-H組和LPS+PMX-B組大鼠LVDP均顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注：A. NC組；B. LPS組；C. LPS+TP-L組；D. LPS+TP-M組；E. LPS+TP-H組；F. LPS+PMX-B組；與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3.3 TP對血管環(huán)張力的影響

3.3.1 TP對Phe誘導(dǎo)的主動脈環(huán)(E+)收縮反應(yīng)的影響 與NC組比較，不同濃度Phe使LPS組主動脈環(huán)的收縮率明顯降低(P<0.05)；與LPS組比較，TP干預(yù)組和LPS+PMX-B組主動脈環(huán)的收縮率明顯上升并呈濃度依賴性遞增(P<0.05)。見圖3。

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3.3.2 TP對Phe誘導(dǎo)的去內(nèi)皮主動脈環(huán)(E-)收縮反應(yīng)的影響 與NC組比較，在不同濃度Phe刺激下，LPS組去內(nèi)皮血管環(huán)的收縮率明顯降低(P<0.05)；與LPS組比較，TP干預(yù)組對不同濃度Phe刺激的去內(nèi)皮血管收縮率無顯著變化(P>0.05)。見圖4。

3.3.3 TP對ACh誘導(dǎo)的主動脈環(huán)(E+)舒張反應(yīng)的影響 與NC組比較，在不同濃度ACh刺激下，LPS組大鼠主動脈環(huán)的舒張率明顯降低(P<0.05)；TP干預(yù)組大鼠主動脈環(huán)舒張率呈濃度依賴性遞增，與LPS組比較，LPS+TP-M組、LPS+TP-H組和LPS+PMX-B組各濃度ACh引起的主動脈環(huán)舒張率均顯著升高(P<0.05)。見圖5。

3.3.4 TP對Phe誘導(dǎo)的L-NAME和MB預(yù)處理主動脈環(huán)(E+)收縮反應(yīng)的影響 L-NAME和MB孵育20 min后，各組主動脈環(huán)在Phe的刺激下，收縮幅度均顯著升高(P<0.05)；而經(jīng)L-NAME預(yù)處理前后，LPS組主動脈環(huán)對10-5mol/L Phe引起的收縮率差值顯著高于LPS+TP-H組和NC組[LPS組(61.55%±14.54%)vsLPS+TP-H組(43.09%±9.75%)，P=0.023；LPS組(61.55%±14.54%)vsNC組(36.75%±17.98%)，P=0.018]。而經(jīng)MB預(yù)處理前后，LPS組主動脈環(huán)對10-5mol/L Phe引起的收縮率差值顯著高于LPS+TP-H組和NC組[LPS組(49.59%±11.49%)vsLPS+TP-H組(32.27%±3.87%)，P=0.023；LPS組(49.59%±11.49%)vsNC組(29.74%±11.39%)，P=0.044]。見表1、表2。

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

圖5 TP對ACh誘導(dǎo)的主動脈環(huán)(E+)舒張反應(yīng)的影響

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05；與LPS+TP-L組比較，◇P<0.05；與LPS+TP-M組比較，◆P<0.05；與LPS+TP-H組比較，□P<0.05；與LPS+PMX-B組比較，▲P<0.05；與NC+L-NAME組比較，△P<0.05；與LPS+L-NAME組比較，◎P<0.05

表2 TP對Phe誘導(dǎo)的MB預(yù)處理主動脈環(huán)(E+)收縮率的影響

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05；與LPS+TP-L組比較，◇P<0.05；與LPS+TP-M組比較，◆P<0.05；與LPS+TP-H組比較，□P<0.05；與LPS+PMX-B組比較，▲P<0.05；與NC+MB組比較，△P<0.05；與LPS+MB組比較，◎P<0.05

4 討論

內(nèi)毒血癥病情兇險(xiǎn)，臨床治療效果不佳，并且具有發(fā)病率及病死率高的特點(diǎn)[9]。因此，尋找一種新的治療方案相當(dāng)重要。本研究采用腹腔注射LPS這一經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法來復(fù)制內(nèi)毒血癥大鼠模型，方便且成功率高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用LPS刺激大鼠6 h后，MABP、HR、LVDP、±dp/dtmax較NC組顯著下降，這與內(nèi)毒血癥的病程發(fā)展相一致[10]。全身性不可逆的血壓降低是內(nèi)毒血癥的主要癥狀，而血壓的調(diào)節(jié)又與血管的張力息息相關(guān)。因此，本研究采用體外胸主動脈血管環(huán)灌流來探究TP對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒血癥大鼠血管張力的影響及其可能的機(jī)制。

TP是從中藥雷公藤提取出來的有效活性成分，其來源廣泛，具有抗炎、抗生育、免疫抑制等藥理作用，但對血管的作用尚不明確[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與LPS組比較，TP干預(yù)組大鼠動脈血壓和心功能等血流動力學(xué)指標(biāo)均明顯改善，主動脈環(huán)對Phe的收縮率亦明顯恢復(fù)，與LPS+PMX-B組的變化趨勢相似。而去內(nèi)皮血管環(huán)實(shí)驗(yàn)顯示，TP干預(yù)組對Phe的收縮率與LPS組無顯著差異。與NC組比較，LPS組血管環(huán)對ACh的舒張率顯著降低，而TP干預(yù)組隨著濃度的升高主動脈血管環(huán)對ACh的舒張率明顯升高，由此推測TP對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒血癥大鼠有保護(hù)作用。后續(xù)的血管環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)NOS阻斷劑L-NAME孵育20 min后，LPS組主動脈環(huán)對10-5mol/L Phe引起的收縮率的差值高于LPS+TP-H組和NC組，提示TP可能降低LPS刺激的NOS過量產(chǎn)生，從而減少NO的過量產(chǎn)生，改善血管環(huán)的收縮率。再者，經(jīng)GC抑制劑MB孵育20 min后，LPS組主動脈環(huán)對10-5mol/L Phe引起的收縮率的差值高于LPS+TP-H組和NC組， 提示TP干預(yù)組可能是通過GC-cGMP途徑，改善主動脈平滑肌的收縮率。

NO是一種舒血管的物質(zhì)，它由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。NO作為氣體很容易擴(kuò)散進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，使鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)被激活，使三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)。細(xì)胞內(nèi)cGMP的含量增多可以激活蛋白激酶G，這是一種可以在很多部位引起蛋白質(zhì)磷酸化的磷酸化酶，最終結(jié)果導(dǎo)致Ca2+外流、膜超極化以及降低收縮結(jié)構(gòu)對Ca2+的敏感性，繼而松弛血管平滑肌，導(dǎo)致血管舒張[12]。主動脈血管環(huán)對Phe誘導(dǎo)的血管收縮的機(jī)制是通過升高血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平來實(shí)現(xiàn)的。有研究表明，LPS刺激產(chǎn)生的炎癥因子可使NOS過量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致NO的過量產(chǎn)生，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，從而導(dǎo)致血管的低反應(yīng)性[13]。

綜上所述，本研究初步探明TP對內(nèi)毒血癥大鼠的血管具有保護(hù)作用，可能是通過改善內(nèi)皮功能而實(shí)現(xiàn)的，確切機(jī)制有待進(jìn)一步探究。