中華圓田螺肉抗氧化肽的分離純化及小鼠體內(nèi)外活性研究

吳明澤 王 笑 胡祥昊 馬青琳 李亞男 董丹華 高 鵬 代 龍

(山東中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250355)

中華圓田螺俗名田螺、香螺，屬軟體動(dòng)物門腹足綱田螺科圓田螺屬[1]，廣泛分布于稻田、湖泊、沼澤、河流、小溪等處，是淡水螺中較大型的食用螺[2]。田螺肉豐腴紅膩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，每100 g內(nèi)含蛋白質(zhì)18.2 g、脂肪0.6 g，還有磷、鈣、鐵、VB以及豐富的VA等，是典型的高蛋白、低脂肪的天然保健食品[2]。鄭漢豐等[3]研究表明，中華圓田螺肉富含人體必需的8種氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的比例均在35%左右，與WHO/FAO模式推薦的模式(35.38%)接近。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多活性氧簇(ROS)自由基，超出機(jī)體清除能力，導(dǎo)致體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡[4]。而體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡與慢性代謝性疾病，如心腦血管疾病、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和癌癥發(fā)生、發(fā)展等[5-6]有關(guān)。目前，中華圓田螺資源開發(fā)集中在普通食品及飼料行業(yè)，楊麗麗等[1]已發(fā)現(xiàn)中華圓田螺抗菌肽對(duì)人體肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但對(duì)其他生物活性尤其是抗氧化活性的研究開發(fā)尚未見報(bào)道。

試驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)堿性蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行雙酶酶解制備中華圓田螺肽，采用超濾、大孔樹脂、葡聚糖凝膠色譜和半制備液相色譜對(duì)其進(jìn)行分離純化，以1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除率、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除率、鐵離子還原能力(FRAP)、氧化自由基吸收能力(ORAC)為指標(biāo)，進(jìn)行活性追蹤，制備獲得活性較高的抗氧化肽，并通過(guò)小鼠體內(nèi)抗氧化酶及MDA增加值的測(cè)定驗(yàn)證其體內(nèi)抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

中華圓田螺：山東省濟(jì)寧市微山湖田螺養(yǎng)殖場(chǎng)；

胰蛋白酶、堿性蛋白酶：1.0×105U/g，上海源葉生物科技有限公司；

昆明種封閉群小白鼠：動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(魯)2017-0011，雌雄各半，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)Elisa試劑盒、微量丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒：武漢純度生物科技有限公司；

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)：美國(guó)Secoma公司；

熒光素鈉(Fluorescein 2Na)、ABTS、DPPH：美國(guó)Sigma公司；

2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、還原型谷胱甘肽、水溶性VE：北京Solarbio公司；

超濾管：1 000，3 000 Da，美國(guó)Millipore公司；

葡聚糖凝：Sephadex G-10型，北京Solarbio公司；

大孔樹脂：DA201-C型，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

電腦自動(dòng)部分收集器：BS-110型，上海精科實(shí)業(yè)公司；

高速組織搗碎機(jī)：JJ-2型，上海谷寧實(shí)業(yè)有限公司；

膜分離設(shè)備：1812型，杭州瑞納膜工程有限公司；

精密增力電動(dòng)攪拌器：JJ-1型，江蘇省金壇市宏華儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

半制備液相色譜系統(tǒng)：LC-20A型，日本島津株式會(huì)社；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1800型，日本島津株式會(huì)社；

分析天平：XS105型，瑞士Mettler Toledo公司；

高速冷凍離心機(jī)：GL-21M型，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田螺肉酶解液的制備 取田螺在水中滴加3滴香油養(yǎng)殖3 d，80 ℃水煮田螺15 min，充分洗凈后，挑出田螺肉，置于冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。稱取田螺肉1 kg，加水5 000 mL 勻漿，85 ℃加熱15 min，冷卻，采用胰蛋白酶、堿性蛋白酶酶解，酶解條件為pH 9、酶解溫度55 ℃、每種酶的酶用量3 000 U/g，酶解時(shí)間3 h，酶解結(jié)束后，酶解液在85 ℃下加熱10 min，5 000 r/min離心5 min，收集上清液凍干以獲得酶解產(chǎn)物，使用前將其冷凍在-20 ℃ 下保存。

1.2.2 田螺肉中抗氧化肽的分離純化

(1)超濾分段：取酶解液凍干粉，用水復(fù)溶，通過(guò)1 000，3 000 Da超濾膜分段為<1 000，1 000～3 000，>3 000 Da 3個(gè)部分，將凍干粉配制成1，2 mg/mL 溶液，測(cè)定各部位的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)，篩選出活性最強(qiáng)的部位進(jìn)行下一步分離純化。

(2)大孔樹脂分離純化：取超濾后體外活性最強(qiáng)的部位凍干粉用水復(fù)溶，濃度為10 mg/mL，將處理好的DA201-C大孔樹脂裝柱(16 mm×190 mm)，樣品上柱。大孔樹脂柱分別用3 BV的去離子水、50%乙醇、75%乙醇洗脫，洗脫流速為1 mL/min，收集各洗脫部位，濃縮凍干后配制為1，2 mg/mL溶液，測(cè)定其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)，篩選出活性最強(qiáng)的部位進(jìn)行下一步分離純化。

(3)凝膠過(guò)濾色譜的分離純化：去大孔樹脂純化后活性最強(qiáng)的部位凍干粉用水復(fù)溶，濃度為25 mg/mL，將處理好的Sephadex G10裝柱(20 mm×100 mm)，樣品上柱。先用去離子水平衡色譜柱，然后進(jìn)行洗脫，洗脫溶劑為去離子水，洗脫流速為1 mL/min，2 mL收集一支EP管，在280 nm下檢測(cè)其吸光度，收集各洗脫峰，濃縮并凍干制備成1，2 mg/mL溶液，測(cè)定其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)，選擇活性最強(qiáng)的部位進(jìn)行下一步的分離。

(4)半制備液相色譜的分離純化樣品：凝膠過(guò)濾色譜所得最強(qiáng)活性部位凍干粉，用水復(fù)溶，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，制備樣品，進(jìn)半制備液相。參考王少平等[7]的色譜條件進(jìn)行半制備液相色譜分離純化，收集各洗脫峰，凍干后制備為1 mg/mL溶液，檢測(cè)其肽含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、鐵離子還原力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)確定活性最強(qiáng)的部位。

1.2.3 肽純度檢測(cè) 將半制備液相色譜分離獲得的活性最強(qiáng)部位，過(guò)0.45 μm濾膜后，利用分析型高效液相色譜儀檢測(cè)其純度。檢測(cè)條件為：BAX-ZOR300SB-C18柱(150 mm×6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：0.1% 三氟乙酸(TFA)；流動(dòng)相B：乙腈+0.1% TFA；梯度洗脫：0～50 min，5% B～50% B；50～65 min，50% B～95% B；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 田螺肽的活性檢測(cè)

(1)DPPH自由基清除率的測(cè)定：根據(jù)Samad等[8]的測(cè)定方法，將2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液(溶劑為無(wú)水乙醇)和2 mL待測(cè)溶液混勻。在室溫暗處?kù)o置30 min后，測(cè)量其在519 nm處的吸光度At。測(cè)定混有蒸餾水的待測(cè)溶液的吸光度Ar以及DPPH溶液的吸光度A0。DPPH自由基清除率c根據(jù)式(1)計(jì)算。

(1)

(2)ABTS自由基清除率的測(cè)定：參照Dauthal等[9]用ABTS和過(guò)硫酸鉀制備自由基溶液，以2.45 mmol/L的終濃度稀釋在水中，并且在黑暗中放置16 h以允許自由基生長(zhǎng)，稀釋溶液以在734 nm處達(dá)到約0.7的吸光度Ao，將0.96 mL ABTS+自由基溶液與0.04 mL各樣品混合，734 nm處反應(yīng)3 min后測(cè)量吸光度Ai，使用去離子水作為空白。ABTS自由基清除率d根據(jù)式(2)計(jì)算。

(2)

(3)鐵離子還原能力的測(cè)定：參照郭曉青等[10]的方法并加以改進(jìn)。在反應(yīng)管中加入100 μL待測(cè)液，再加入2.4 mL FRAP工作液，37 ℃水浴10 min，于593 nm 處測(cè)定吸光度。以0.1～1.6 mmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液替代樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以1.0 mmol/L的FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度值為一個(gè)FRAP值，計(jì)算結(jié)果。

(4)ORAC的測(cè)定：參照戴慧卿等[11]的方法，將供試品熒光衰減曲線下的保護(hù)面積代入Trolox方程，得到供試品的ORAC，結(jié)果用Trolox濃度表示。

(5)肽含量的測(cè)定：在反應(yīng)管中加入1 mL待測(cè)液，再加入1 mL堿性銅試劑和4 mL福林酚試劑，55 ℃下反應(yīng)5 min，冰水浴10 min，于650 nm處測(cè)定吸光度。以0.0～0.2 mg/mL牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)液替代樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。

(3)

式中：

w——肽含量，%；

c——待測(cè)液濃度(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算)，mg/mL；

V——待測(cè)液體積，mL；

m——待測(cè)物質(zhì)量，mg。

1.2.5 田螺肽的體內(nèi)抗氧化活性檢測(cè)

(1)小鼠飼養(yǎng)及訓(xùn)練條件：小鼠按照體重隨機(jī)分組，共5組，1個(gè)空白組、3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組。日常自由飲食，灌胃飼養(yǎng)40 d，運(yùn)動(dòng)前1.5 h灌胃，空白組灌胃雙蒸水，試驗(yàn)組灌胃中華圓田螺抗氧化肽，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃谷胱甘肽，飼喂量為小鼠體重的3%。每日游泳訓(xùn)練1次，不負(fù)重，每次30 min，水溫(30±2)℃。

(2)血清、組織勻漿的制備及指標(biāo)檢測(cè)：參照文獻(xiàn)[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，方法為Duncan multiple，P<0.05為差異顯著。采用Origin 2017b進(jìn)行作圖[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田螺肽的分離純化

2.1.1 超濾 如圖1所示，各項(xiàng)指標(biāo)隨樣品濃度的增加而增大。在濃度為2 mg/mL時(shí)，<1 kDa部位的DPPH自由基清除率為76.81%，顯著高于其他兩個(gè)部位(P<0.05)；兩個(gè)濃度下，<1 kDa部位的ORAC均顯著高于另外兩個(gè)部位(P<0.05)，<1 kDa和1～3 kDa部位的ABTS自由基清除率和FRAP相當(dāng)且均高于>3 kDa部位的。分子量較小的<1 kDa部位具有良好的捕捉DPPH、ABTS自由基電子的能力及還原物質(zhì)的能力。

2.1.2 大孔樹脂分離純化 將<1 kDa部位經(jīng)DA201-C大孔樹脂分離為水、50%乙醇、75%乙醇洗脫部位。由圖2 可知，各指標(biāo)均隨樣品濃度增大而增大，在1，2 mg/mL 下水洗脫部位的DPPH自由基清除率分別為57.23%，80.14%，F(xiàn)RAP分別為0.387，0.734，ORAC分別為854.23，1 576.76 μmol/L，均顯著高于其他兩個(gè)部位的(P<0.05)；ABTS自由基清除率分別為48.27%，88.23%，與75%乙醇部位的相當(dāng)。以上表明，經(jīng)大孔樹脂分離的極性較大的<1 kDa水部位具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.1.3 凝膠過(guò)濾色譜分離純化 由圖3可以看出，水洗脫部位經(jīng)Sephadex G-10分離后被分成了3個(gè)部位。

由圖4可以看出，3個(gè)部位的各項(xiàng)指標(biāo)隨著樣品濃度增大而增大。峰2的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、FRAP、ORAC在1，2 mg/mL時(shí)都為最大，分別為61.28%，89.21%；55.29%，90.87%；0.409，0.816；902.67，1 632.45 μmol/L，均顯著高于其他部位的(P<0.05)。結(jié)果表明峰2部位具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

同一濃度小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

同一濃度小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.4 半制備液相色譜純化 由圖5可知，凝膠過(guò)濾色譜得到的2號(hào)峰經(jīng)過(guò)半制備液相色譜分離純化后被分成了4個(gè)部位。

由圖6可知，在酶解液濃度1 mg/mL時(shí)，峰2的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率最強(qiáng)分別為60.42%，54.96%；ORAC也最高，為932.58 μmol/L，且均顯著高于其他組(P<0.05)；FRAP低于峰3，為0.378。以谷胱甘肽為陽(yáng)性對(duì)照，1 mg/mL谷胱甘肽溶液的DPPH自由基清除率為65.29%，ABTS自由基清除率為62.09%，F(xiàn)RAP為0.599，ORAC為937.37 μmol/L。峰2的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率略低于谷胱甘肽，ORAC與谷胱甘肽相當(dāng)。ORAC法是基于氫原子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)，目前氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)被認(rèn)為是自由基氧化反應(yīng)的主要機(jī)制[14]，因此，峰2為抗氧化活性最強(qiáng)的部位。

圖3 1 kDa部位凝膠過(guò)濾色譜圖

同一濃度小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖5 半制備液相色譜分離色譜圖

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 抗氧化肽純度

所得肽段經(jīng)肽含量測(cè)定為(78.65±2.02)%，如圖7所示，半制備液相色譜所得2號(hào)峰主要為1個(gè)大峰，通過(guò)歸一化法計(jì)算得到峰面積占比達(dá)到90%以上，說(shuō)明通過(guò)分離純化最終得到一個(gè)純度較高的抗氧化肽片段[15]。

圖7 分析液相色譜圖

2.3 抗氧化肽的體內(nèi)抗氧化活性

由圖8可知，試驗(yàn)組小鼠的血清中過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-PX)、總抗氧化能力(T-AOC)的活力與空白組相比均增大，且差異顯著(P<0.05)，除GSH-PX外，試驗(yàn)組與谷胱甘肽陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明各種抗氧化酶在體內(nèi)均發(fā)揮了與谷胱甘肽相當(dāng)?shù)囊种谱杂苫淖饔?。試?yàn)組的MDA生成量明顯低于對(duì)照組，且與谷胱甘肽相當(dāng)，以上表明中華圓田螺抗氧化肽具有顯著的體內(nèi)抗氧化活性。

同一項(xiàng)目小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

對(duì)中華圓田螺肉堿性蛋白酶、胰蛋白酶雙酶酶解液進(jìn)行分離純化，經(jīng)超濾、大孔樹脂、凝膠過(guò)濾色譜和半制備液相色譜分離后，獲得了一個(gè)純度和體外抗氧化活性均較高的肽段。試驗(yàn)對(duì)中華圓田螺肽中抗氧化活性肽進(jìn)行了研究，據(jù)多項(xiàng)研究表示，抗氧化活性與多種氨基酸的作用息息相關(guān)，如亮氨酸等疏水性氨基酸[16]，而中華圓田螺中有含量較高的亮氨酸[17]，此外，多種氨基酸構(gòu)成的小肽比氨基酸活性更強(qiáng)，可能與機(jī)體更高的相容性、易吸收及氨基酸的相互作用有關(guān)[18]。但試驗(yàn)針對(duì)中華圓田螺分離純化所得抗氧活性肽未進(jìn)行肽序測(cè)定及接下來(lái)的活性研究，對(duì)于體內(nèi)活性測(cè)定的指標(biāo)較為簡(jiǎn)單，還需進(jìn)一步研究。