龍須菜四分孢子體不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因克隆和啟動(dòng)子區(qū)分析與刺激響應(yīng)研究?

李曉東， 隋正紅， 彭 沖， 王津果， 劉昊昕

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)隸屬于江蘺科(Gracilariaceae)[1-2]，是我國重要的經(jīng)濟(jì)海藻和生產(chǎn)瓊膠的重要原料[3]。龍須菜的生活史可以在實(shí)驗(yàn)室條件下完成，具備進(jìn)行遺傳學(xué)研究的基本條件[4]。

龍須菜的生活史屬于真紅藻綱典型的三世代型生活史，由2個(gè)二倍體的孢子體世代(四分孢子體、附生生長果孢子)和1個(gè)單倍體的配子體世代組成[5]。在整個(gè)生活史過程中，四分孢子是由二倍體的四分孢子體經(jīng)過減數(shù)分裂形成并放散的，放散到體外后會(huì)選擇合適的基質(zhì)附著進(jìn)而發(fā)育形成單倍的雌雄配子體。四分孢子體是龍須菜二倍體形成單倍體的一個(gè)中間重要環(huán)節(jié)，也是龍須菜栽培產(chǎn)業(yè)中的主要材料。

育性在龍須菜中主要體現(xiàn)為二倍體(四分孢子體)產(chǎn)生四分孢子和單倍體(配子體)產(chǎn)生果孢(雌配子)與精子(雄配子)的能力。龍須菜配子體中，囊果數(shù)或其分布密度是作為判斷配子體育性高低的指標(biāo)，而四分孢子體四分孢子囊數(shù)量和四分孢子放散量可以作為孢子體育性高低的指標(biāo)[6]。

目前常用的栽培品種“981”四分孢子放散量極低，與“魯龍1號(hào)”四分孢子體的放散量相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[6]，即 “981”具有低育性。對(duì)于藻類而言，低育意味著形成或者放散的生殖細(xì)胞數(shù)量較少，從而對(duì)藻體造成的損傷面積相對(duì)較小，張祐基等強(qiáng)調(diào)較小的成熟面積是優(yōu)良品系的一個(gè)突出性狀[7]。對(duì)四分孢子體發(fā)育過程進(jìn)行研究，有助于深入了解種群是如何維持和繁殖的，揭示藻類生殖發(fā)育過程中的遺傳調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而獲得與育性相關(guān)的重要基因和信息，在藻類遺傳育種、獲得優(yōu)良品種方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

龍須菜四分孢子體的發(fā)育過程分為4個(gè)階段——未成熟期(Ⅰ階段)、成熟期(Ⅱ階段)、放散期(Ⅲ階段)、成熟后期(Ⅳ階段)。王津果對(duì)“981”和“魯龍1號(hào)”四分孢子體不同發(fā)育階段的樣品進(jìn)行了數(shù)字表達(dá)譜(Digital Gene Expression，DGE)分析，揭示了2個(gè)品種在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ階段基因表達(dá)水平的變化[6]。“981”II階段形成四分孢子囊數(shù)量顯著少于“魯龍1號(hào)”，且畸形率高，這些特點(diǎn)均與其低育特性吻合。本研究通過檢索“981”II階段相對(duì)I階段的高差異表達(dá)基因，并結(jié)合“981”和“魯龍1號(hào)”在II階段差異基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，選擇D-乳酸脫氫酶(D-lactate dehydrogenase，dld)，谷氨酰胺合成酶(glutamine，gln2)和熱激蛋白(hot shock protein，hsp15.4)作為研究基因。

D-乳酸脫氫酶是一種以NAD+為氫受體，作用于D-乳酸，用于催化乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)化的酶。在乳酸菌有氧培養(yǎng)中，沒有或極少量的葡萄糖濃度條件下(<0.5%)，dld的活性降低，大量孢子產(chǎn)生；加入大量葡萄糖后(濃度>20%)，dld的活性增加，抑制孢子形成，說明dld可能與乳酸菌生殖細(xì)胞形成時(shí)期的調(diào)控有關(guān)[8]。

在高等植物中，谷氨酰胺合成酶是氮素代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，它可以聯(lián)合谷氨酸合成酶催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[9]。谷氨酰胺合成酶在盤基網(wǎng)柄菌孢子母細(xì)胞中的活性比在柄細(xì)胞中的活性高約4倍，為谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育提供了證據(jù)[10]。谷氨酰胺合成酶在水稻花粉成熟過程中起到重要作用，谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)量低的植株雖然可以完成整個(gè)生育期，但受精形成的種子數(shù)量少于正常植株[11]。

熱激蛋白是一類廣泛分布于各類生物細(xì)胞內(nèi)且高度保守的蛋白分子，在高溫、干旱、過氧化、重金屬等逆境下均能大量表達(dá)[12]，主要通過參與蛋白合成、折疊、細(xì)胞定位及蛋白降解等多種生物功能來維持植物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]，在植物抵御逆境及適應(yīng)環(huán)境中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞各項(xiàng)正常生理活動(dòng)[14-15]。在對(duì)小麥發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的研究中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)熱激蛋白hsp23.5基因的表達(dá)，可增大花粉的育性[16]。

啟動(dòng)子區(qū)是位于DNA上基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前1 500～2 000 bp的一段序列，在啟動(dòng)子區(qū)存在許多重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，這些調(diào)控元件響應(yīng)不同的信號(hào)刺激，從而針對(duì)不同的刺激控制下游基因的表達(dá)。研究基因啟動(dòng)子元件對(duì)于解析基因表達(dá)調(diào)控具有重要意義。

本研究克隆得到了龍須菜dld基因完整的ORF及上游啟動(dòng)子區(qū)序列，對(duì)ORF編譯的氨基酸序列進(jìn)行了信號(hào)肽、跨膜區(qū)、蛋白結(jié)構(gòu)域的分析，并進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)合gln2、hsp15.4啟動(dòng)子區(qū)序列，預(yù)測(cè)得到了基因調(diào)控的順式作用元件。根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)置龍須菜誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，通過半定量PCR分析在誘導(dǎo)條件下基因表達(dá)量變化，探究3個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

龍須菜“魯龍1號(hào)”的四分孢子體樣品采集于青島膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)(36°08′N, 120°17′E)。將表面的附生生物、泥沙等肉眼可見的污染物沖洗干凈后，挑選生長狀態(tài)良好的藻株置于潔凈滅菌的1 L廣口錐形瓶中，加入含有Pro培養(yǎng)基的滅菌海水，置于22 ℃、鹽度30、光照50 μmol·m-2·s-1、光暗周期12 h∶12 h的條件下馴養(yǎng)1周，中間更換1次海水，加入新的培養(yǎng)基。

馴化培養(yǎng)結(jié)束后，按照如下培養(yǎng)條件進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)均置于250 mL的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中加入4株生長狀況良好的龍須菜。

光照強(qiáng)度誘導(dǎo)：分為高光照強(qiáng)度(50 μmol·m-2·s-1)，正常光照(30 μmol·m-2·s-1)，無光照強(qiáng)度(0 μmol·m-2·s-1)，培養(yǎng)時(shí)間為1、3 d。其他培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃，鹽度33，光暗周期12 h∶12 h。

茉莉酸甲酯處理：茉莉酸甲酯濃度為0、100、200、500 μmol/L，處理時(shí)間為0、30、60 min。其他培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度30 μmol·m-2·s-1，溫度20 ℃，鹽度33，光暗周期12 h∶12 h。

材料處理后，每個(gè)處理組取3株生長狀況一致的龍須菜切尖，液氮中速凍后置于-80 ℃保存。

1.2 基因組DNA的提取及cDNA的制備

利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根)提取龍須菜樣品基因組DNA。利用植物RNA提取試劑盒(OMEGA)提取龍須菜樣品總RNA，并利用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)提取RNA的濃度以及OD260/OD280，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃條件下保存。

1.3 不同階段差異表達(dá)基因的分析及克隆

將“981” I階段的表達(dá)譜數(shù)據(jù)與其II階段的數(shù)據(jù)[6]進(jìn)行對(duì)比分析，篩選得到差異表達(dá)10倍以上的(|log2Fold Change |> 3.333 3)基因；篩選“981”與“魯龍1號(hào)”在II階段的差異表達(dá)基因(padj < 0.05)[6]；將上述得到的2組差異表達(dá)基因取交集，這些基因即為可能參與龍須菜生殖細(xì)胞形成時(shí)期(II階段)調(diào)控的育性相關(guān)基因，且與“981”低育特性存在聯(lián)系。通過本地BLAST將上述基因注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，從功能已知的基因中檢索，選擇有文獻(xiàn)報(bào)道的功能與育性相關(guān)的基因——dld、gln2、hsp15.4作為本研究的目的基因。

將3個(gè)基因的序列與龍須菜全基因組Survey數(shù)據(jù)[19]進(jìn)行比對(duì)，得到基因的上下游序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)dld基因的全長擴(kuò)增引物(-all)和3個(gè)基因半定量引物(-q)，選擇18SrRNA基因[20]作為半定量PCR的內(nèi)參基因(見表1)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 The sequence of primers used in this study

PCR反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 2 μL，25 mmol/ L的MgCl21.2 μL，2.5 mmol/ L的dNTP 1.5 μL，10 μmol/ L的正反向引物各1 μL，1 μL的Taq DNA聚合酶和20 ng全基因組DNA模板。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s(在全基因克隆的擴(kuò)增反應(yīng)中設(shè)為45 s)，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

dld全基因擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)進(jìn)行目的條帶回收。參照PMD18-T說明書，將回收的目的條帶與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株中，PCR檢測(cè)顯示陽性克隆的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h。菌液送上海生工生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 序列的生物信息學(xué)分析

用BioEdit v7.0軟件檢查雙向測(cè)序的結(jié)果，刪除序列兩端背景雜亂堿基，并利用MEGA6.0軟件拼接得到基因全長序列和上游序列，分別與龍須菜轉(zhuǎn)錄組和全基因組Survey數(shù)據(jù)中基因所在的Scaffold片段進(jìn)行比對(duì)，確定目的基因的存在及其序列信息。利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推測(cè)開放閱讀框，結(jié)合MEGA6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列翻譯。蛋白質(zhì)的分子量與等電點(diǎn)使用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白信號(hào)肽；跨膜區(qū)通過TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行分析；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析；將獲得的dld氨基酸序列在NCBI上通過BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，下載同源性最高的15個(gè)物種的氨基酸序列，使用Clustal X軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析，通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Bootstrap法對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行評(píng)估，Bootstrap設(shè)置為1 000次重復(fù)。利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)獲得的dld、gln2、hsp15.4基因的上游序列的啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，每個(gè)基因的預(yù)測(cè)區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1 500 bp序列。

1.5 半定量PCR循環(huán)數(shù)的確定

首先按照以下組分配置半定量PCR反應(yīng)液：不同處理下cDNA模板1 μL，10× PCR緩沖液2 μL，Mg2+溶液(25 mm) 2 μL，dNTP Mix溶液(2 mm) 2 μL，各基因半定量正向引物(10 μmol/L)1 μL，各基因半定量反向引物(10 μmol/L)1 μL，Taq聚合酶0.1 μL，加ddH2O至20 μL。設(shè)置PCR循環(huán)數(shù)梯度為15～28個(gè)循環(huán)，半定量PCR反應(yīng)按照如下程序進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，延伸30 s，進(jìn)行15～28個(gè)循環(huán)；延伸10 min。半定量PCR結(jié)束后，對(duì)每個(gè)處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳條帶使用Gelpro32軟件進(jìn)行分析。

1.6 不同處理樣品表達(dá)量的檢測(cè)

通過上一步實(shí)驗(yàn)確定半定量PCR的循環(huán)數(shù)，以誘導(dǎo)培養(yǎng)材料的cDNA為模板，其余PCR反應(yīng)體系和程序與上一步相同，每個(gè)處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳條帶使用Gelpro32軟件進(jìn)行分析，并用SPSS 22軟件處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 dld基因的克隆及氨基酸序列分析

克隆得到dld基因ORF序列全長1 674 bp，編碼557個(gè)氨基酸，分子量為59 900.55，理論等電點(diǎn)為6.58。帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp、Glu)為63個(gè)，帶正電的氨基酸殘基(Arg、Lys)為60個(gè)，不存在信號(hào)肽，存在2個(gè)跨膜區(qū)，分別為TM1(位置56～78 aa，長度23 aa，方向?yàn)槟?nèi)向膜外)，TM2(228～248 aa，長度21 aa，方向?yàn)槟ね庀蚰?nèi))。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在2～71 aa的位置，存在一段長70 aa的低復(fù)雜性區(qū)域(Low complexityregion，LCR)。D-乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域在312～553 aa處。龍須菜dld基因編碼氨基酸序列與同屬紅藻門的臍形紫菜Porphyraumbilicalis序列結(jié)構(gòu)相近，而與雙子葉植物差異較多(見圖1)。

DWI技術(shù)檢測(cè)出534枚淋巴結(jié)，179枚淋巴結(jié)為良性，其中病理證實(shí)為惡性者57枚、良性者122枚；DWI技術(shù)檢測(cè)出355枚為惡性，其中病理證實(shí)為惡性者290枚、良性者65枚。統(tǒng)計(jì)檢測(cè)所得數(shù)據(jù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，具體統(tǒng)計(jì)情況見表1。

(實(shí)線框表示預(yù)測(cè)跨膜區(qū)，雙箭頭實(shí)線表示預(yù)測(cè)LCR區(qū)，實(shí)線表示預(yù)測(cè)的dld結(jié)構(gòu)域；相同氨基酸用“*”表示，相似氨基酸用“·”與“：”表示。The box, transmembrane region; Double-headed arrow, low complexityregion; Solid line,dldprotein domains; “*”, same amino acids; “·” and “:”, similar amino acids.)

圖1dld基因編碼氨基酸序列比對(duì)結(jié)果
Fig.1 The amino acid sequences alignment ofdld

2.2 氨基酸序列進(jìn)化分析

基于dld基因編碼的氨基酸序列所構(gòu)建的NJ樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)主要分為2個(gè)類群(見圖2)，其中龍須菜與臍形紫菜聚為一支，二者均屬于紅藻門，其他雙子葉植物聚為另一大支。

2.3 dld、gln2、hsp15.4基因上游序列的啟動(dòng)子元件分析

克隆得到dld基因上游序列1 500 bp，結(jié)合hsp15.4和gln2基因上游序列[21]進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)分析。預(yù)測(cè)各基因啟動(dòng)子區(qū)作用元件20種(見表2)，分為光照、激素和其它3大類。其中光照刺激響應(yīng)原件最多，dld基因有11處，gln2基因有6處，hsp15.4基因有11處。根據(jù)元件預(yù)測(cè)結(jié)果，并且考慮到實(shí)驗(yàn)操作性與可行性，本研究對(duì)光照響應(yīng)(Light responsiveness)和茉莉酸甲酯響應(yīng)(MeJA-responsiveness)設(shè)置誘導(dǎo)條件進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 基于dld基因編碼氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹Fig.2 NJ tree based on amino acid sequence of dld2.3 dld、gln2、hsp15.4基因上游序列的啟動(dòng)子元件分析

功能Function dldgln2hsp15.4光照相關(guān)Light光照響應(yīng)元件Light responsive element11611部分光照響應(yīng)元件Part of a light responsive element373光照響應(yīng)順式作用元件Cis-acting element involved in light responsiveness121光照響應(yīng)順式作用調(diào)控元件Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness565光照響應(yīng)相關(guān)保守DNA區(qū)域Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness020激素相關(guān)Hormone茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness464脫落酸響應(yīng)順式作用元件Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness222脫落酸與VP1響應(yīng)順式作用元件Cis-acting element involved in ABA and VP1 responsiveness010赤霉素響應(yīng)元件Gibberellin-responsive element101其它OthersMYBHv1 結(jié)合位點(diǎn) MYBHv1 binding site323真菌誘導(dǎo)因子響應(yīng)元件Fungal elicitor responsive element010缺氧應(yīng)答增強(qiáng)子元件Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility212

續(xù)表2

功能Function dldgln2hsp15.4核心啟動(dòng)子元件Core promoter element around -30 of transcription start313常見的順式作用元件Common cis-acting element in promoter and enhancer regions141414胚乳表達(dá)順式作用元件Cis-regulatory element involved in endosperm expression121其它Others胚乳表達(dá)必要的順式作用元件Cis-acting regulatory element required for endosperm expression333分生組織激活順式作用元件Cis-acting regulatory element related to meristem specific activation110細(xì)胞循環(huán)管理順式作用元件Cis-acting element involved in cell cycle regulation101低溫應(yīng)答順式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness010

2.4 半定量PCR確定基因的表達(dá)量變化

2.4.1 半定量PCR循環(huán)數(shù)的確定及內(nèi)參基因的擴(kuò)增 對(duì)設(shè)置的PCR循環(huán)數(shù)梯度(15～28個(gè)循環(huán))的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢驗(yàn)。圖3表示循環(huán)數(shù)為20～25的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。結(jié)果顯示，當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)為23時(shí)，開始出現(xiàn)目的條帶。循環(huán)數(shù)為24時(shí)，目的條帶亮度增加，說明循環(huán)數(shù)24時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物仍處于指數(shù)增長階段，因此本研究選擇以24作為半定量PCR確定基因表達(dá)量的循環(huán)數(shù)(見圖3)。

(1～6代表循環(huán)數(shù)為20～25，M為marker DL2000。No.1～No.6.The cycle number 20-25; M.DL2000.)

圖3 確定半定量PCR循環(huán)數(shù)
Fig.3 The cycle number determination of semi-quantitative PCR

本研究采用龍須菜實(shí)驗(yàn)中常用的18SrRNA基因作為內(nèi)參基因，對(duì)18SrRNA基因在不同誘導(dǎo)條件龍須菜中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，圖4表示18SrRNA的表達(dá)結(jié)果穩(wěn)定。

(M．DL2000; 1．無光培養(yǎng)1 d；2．正常光培養(yǎng)1 d；3．強(qiáng)光培養(yǎng)1 d；4．無光培養(yǎng)3 d；5．正常光培養(yǎng)3 d；,6．強(qiáng)光培養(yǎng)3 d；7、8．馴化后無處理；9．100 μmol/L MeJA培養(yǎng)30 min；10．200 μmol/L MeJA培養(yǎng)30 min；11．500 μmol/L MeJA培養(yǎng)30 min；12．100 μmol/L MeJA培養(yǎng)1 h；13．200 μmol/L MeJA培養(yǎng)1 h；14，500 μmol/L MeJA培養(yǎng)1 h。M: d2000; 1．One cultivation day without illumination; 2．One cultivation day with normal illumination intensity; 3．One cultivation day with high illumination intensity; 4．Three cultivation days without illumination; 5．three cultivation days with normal illumination intensity; 6．Three cultivation days with high illumination intensity; 7,8．Normal group (no treatment after one week cultivation within lab) ; 9．30 minutes under 100 μmol/L MeJA condition; 10．30 minutes under 200 μmol/L MeJA condition; 11．30 minutes under 500 μmol/L MeJA condition; 12．1 hour under 100 μmol/L MeJA condition; 13．1 hour under 200μmol/L MeJA condition; 14．1 hour under 500 μmol/L MeJA condition.)

圖4 內(nèi)參基因18SrRNA擴(kuò)增結(jié)果
Fig.4 The amplification result of 18SrRNAreference gene

2.4.2 光照處理下基因的表達(dá)量變化 圖5所示為不同光照強(qiáng)度下誘導(dǎo)3 d時(shí)間，龍須菜育性相關(guān)基因dld、gln2、hsp15.4的半定量PCR電泳圖。無光照條件下，所有基因的電泳條帶亮度均很弱，說明基因表達(dá)量均較低；正常光照與高光照條件下，基因的電泳條帶亮度均高于無光照條件下電泳條帶亮度，說明光照強(qiáng)度刺激可以促進(jìn)dld、gln2、hsp15.4基因的表達(dá)。

相同光照和相同處理時(shí)間下，hsp15.4的表達(dá)量最高，gln2的表達(dá)量最低。

無光和強(qiáng)光條件下，處理1和3 d，3個(gè)基因的表達(dá)量差異不顯著；正常光照下，處理1和3 d，3個(gè)基因的表達(dá)量差異顯著(見圖6)。

2.4.3 茉莉酸甲酯處理下基因的表達(dá)量變化 圖7所示為不同茉莉酸甲酯誘導(dǎo)條件下，龍須菜育性相關(guān)基因dld、gln2、hsp15.4的半定量PCR電泳圖。低茉莉酸甲酯濃度下，所有基因的電泳條帶亮度均很弱，說明基因表達(dá)量均較低；隨著茉莉酸甲酯濃度升高以及誘導(dǎo)時(shí)間增加，基因的電泳條帶亮度增加，說明茉莉酸甲酯刺激可以促進(jìn)dld、gln2、hsp15.4基因的表達(dá)。

相同茉莉酸甲酯濃度和相同誘導(dǎo)時(shí)間下，hsp15.4的表達(dá)量最高，gln2的表達(dá)量最低。

茉莉酸甲酯誘導(dǎo)30 min和1 h，隨著濃度升高(0、100、200和500 μmol/L)，dld、gln2、hsp15.4基因的表達(dá)量均增加。相同茉莉酸甲酯濃度，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，3個(gè)基因的表達(dá)量均增加；誘導(dǎo)時(shí)間1 h，3個(gè)基因的表達(dá)量均顯著高于未誘導(dǎo)條件下的基因表達(dá)量。

茉莉酸甲酯濃度為100 μmol/L，處理30 min，dld、gln2、hsp15.4基因的表達(dá)量增加不顯著；當(dāng)茉莉酸甲酯濃度為200和500 μmol/L時(shí)，誘導(dǎo)30 min，3個(gè)基因的表達(dá)量均顯著增加(見圖8)。

(M．DL2000；1、4、7、10、13、16、19為dld基因；2、5、8、11、14、17、20為gln2基因；3、6、9、12、15、18、21為hsp15.4基因；1～3．馴化后無處理；4～6．無光培養(yǎng)1 d；7～9．正常光培養(yǎng)1 d；10～12．強(qiáng)光培養(yǎng)1 d；13～15．無光培養(yǎng)3 d；16～18．正常光培養(yǎng)3 d；19～21．強(qiáng)光培養(yǎng)3 d。M． DL2000; 1,4,7,10,13,16,19,dld; 2,5,8,11,14,17,20,gln2; 3,6,9,12,15,18,21hsp15.4; 1～3．Normal group (no treatment after one week cultivation within lab); 4～6．One cultivation day without illumination; 7～9．One cultivation day with normal illumination intensity; 10～12．One cultivation day with high illumination intensity; 13～15．Three cultivation days without illuminationy; 16～18．Three cultivation days with normal illumination intensity;19～21．Three cultivation days with high illumination intensity.)

圖5 不同光照處理下基因的表達(dá)電泳圖
Fig.5 The electrophoresis result of gene expression under different illumination intensity

(a．無光； b．正常光照；c．強(qiáng)光光照。圖中不同小寫字母表示相同光照強(qiáng)度下不同光照時(shí)間組的組間差異顯著，相同小寫字母表示差異不顯著，P<0.05。a． No light condition; b．Normal illumination condition; c． High illumination condition. The different lowercase letters denote significant differences between the groups exposed to the same illumination under treatment of different times. The same lowercase letters denote insignificant differences between the groups exposed to the same illumination under treatment of different times.P<0.05.)

圖6 不同光照處理下不同時(shí)間基因的表達(dá)量
Fig.6 Gene expression under different illumination conditions in different times

(M，DL2000；1、4、7、10、13、16為dld基因；2、5、8、11、14、17為gln2基因；3、6、9、12、15、18為hsp15.4基因；1～3．100 μmol/L MeJA培養(yǎng)30 min；4～6．200 μmol/L MeJA培養(yǎng)30 min；7～9．500 μmol/L MeJA培養(yǎng)30 min；10～12．100 μmol/L MeJA培養(yǎng)1 h；13～15．200 μmol/L MeJA培養(yǎng)1 h；16～18．500 μmol/L MeJA培養(yǎng)1 h。M: DL2000; 1,4,7,10,13,16:dld; 2,5,8,11,14,17:gln2; 3,6,9,12,15,18:hsp15.4; 1～3．30 minutes under 100 μmol/L MeJA condition; 4～6．30 minutes under 200μmol/L MeJA condition; 7～9． 30 minutes under 500 μmol/L MeJA condition; 10～12．1 hour under 100 μmol/L MeJA condition; 13～15． 1 hour under 200 μmol/L MeJA condition; 16～19．1 hour under 500μmol/L MeJA condition.)

圖7 不同茉莉酸甲酯誘導(dǎo)條件下基因的表達(dá)電泳圖
Fig.7 The electrophoresis result of gene expression under different MeJA conditions

(a．100 μmol/L； b.200 μmol/L； c.500 μmol/L。圖中不同小寫字母表示相同茉莉酸甲酯濃度下不同誘導(dǎo)時(shí)間組間差異顯著，相同小寫字母表示差異不顯著，P<0.05。a.100 μmol/L MeJA conditions; b.200μmol/L MeJA conditions; c.500 μmol/L MeJA conditions. The different lowercase letters denote significant differences between the groups exposed to the same MeJA condition under treatment of different times. The same lowercase letters denote insignificant differences between the groups exposed to the same MeJA condition under treatment of different times.P<0.05.)

圖8 不同茉莉酸甲酯濃度誘導(dǎo)下不同時(shí)間基因的表達(dá)量
Fig.8 Gene expression under different MeJA conditions in different times

3 討論

龍須菜作為重要的養(yǎng)殖海藻，匱乏的栽培品種限制著龍須菜養(yǎng)殖規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大。尋找龍須菜育性控制基因，并探究其表達(dá)調(diào)控機(jī)理，可望為實(shí)現(xiàn)龍須菜育性調(diào)控及新品種的培育奠定基礎(chǔ)。

龍須菜由無四分孢子囊(Ⅰ階段)到形成大量四分孢子囊(Ⅱ階段)代表著龍須菜由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變到生殖生長，這一時(shí)期高差異表達(dá)基因，極有可能在四分孢子囊形成過程中扮演著重要角色；在Ⅱ階段 “981”與 “魯龍1號(hào)”的差異表達(dá)基因則有可能與兩者的育性差別存在聯(lián)系。本研究通過對(duì)上述2組表達(dá)譜數(shù)據(jù)的篩選，找到了3個(gè)育性控制相關(guān)基因：dld、gln2、hsp15.4。

數(shù)字表達(dá)譜分析顯示，3個(gè)基因在2個(gè)品種的不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)(見表3)。在龍須菜四分孢子體發(fā)育的成熟期(Ⅱ階段)，“981”中dld基因的表達(dá)量顯著高于與“魯龍1號(hào)”中該基因的表達(dá)量(p<0.05)?！?81”在成熟期形成的四分孢子數(shù)量遠(yuǎn)低于“魯龍1號(hào)”，相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；在乳酸菌中，dld基因的高表達(dá)會(huì)抑制孢子的形成[8]。推測(cè)dld基因可能與龍須菜育性控制相關(guān)，其高表達(dá)與“981”的低育特性存在聯(lián)系。蔡紅梅在水稻花粉中發(fā)現(xiàn)的gln2基因的抑制表達(dá)會(huì)使水稻育性降低[11]。與dld基因的表達(dá)結(jié)果不同，表達(dá)譜分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)gln2基因在“981”成熟期(Ⅱ階段)的表達(dá)量低于“魯龍1號(hào)”(p<0.05)，證明了低育品種中g(shù)ln2基因表達(dá)量要低于正常品種，gln2基因可能與龍須菜育性控制相關(guān)。趙建平等將熱激蛋白基因分為3類：與發(fā)育階段特異性表達(dá)相關(guān)的hsp基因、和發(fā)育階段及脅迫誘導(dǎo)都相關(guān)的hsp基因、僅與脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的hsp基因[22]。表達(dá)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hsp15.4基因在“981”成熟期(Ⅱ階段)和成熟后期(Ⅳ階段)的表達(dá)量均高于未成熟期(Ⅰ階段)。龍須菜在放散四分孢子后，表面形成大面積創(chuàng)傷，hsp15.4基因在Ⅳ階段的高表達(dá)可能與其抗逆特性相關(guān)。推測(cè)hsp15.4基因在龍須菜不同階段發(fā)揮不同的功能作用，參與育性控制及抗逆表達(dá)調(diào)控。

表3 3個(gè)基因在2個(gè)品種的不同發(fā)育階段表達(dá)譜數(shù)據(jù)Table 3 DGE data of three selected genes within different development stages of two cultivars

注：Gene ID:基因ID號(hào)；log2FoldChange:log2(Sample1_readcount/Sample2_readcount); log2Foldchange>0，則認(rèn)為該差異基因是上調(diào)，log2Foldchange<0，認(rèn)為該差異基因是下調(diào)；|log2Foldchange|越大，差異倍數(shù)越大。Gene ID: Gene ID in DGE; log2FoldChange: log2(Sample1_readcount/Sample2_readcount); log2Foldchange>0 means up-regulated gene expression, log2Foldchange<0 means down-regulated gene expression; The larger the |log2Foldchange|, the greater the difference.

本實(shí)驗(yàn)克隆得到了龍須菜dld基因，預(yù)測(cè)未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，該結(jié)果與龍須菜gln2、hsp15.4基因一致，表明3個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)均為非分泌型蛋白。龍須菜dld基因編碼氨基酸序列與臍形紫菜最為相近?？缒^(qū)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)氨基酸序列存在2個(gè)跨膜區(qū)，說明其為跨膜蛋白。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)2～71 aa為低復(fù)雜性區(qū)域(LCR)，LCR是指該蛋白質(zhì)片段中重復(fù)出現(xiàn)一種或少數(shù)幾種氨基酸，氨基酸的多樣性比較低[23]。LCR常與信號(hào)序列、疏水骨架、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等信息有關(guān)，LCR在蛋白質(zhì)的含量隨半衰期的增長而增多，長壽命蛋白質(zhì)序列中含有低復(fù)雜度區(qū)域的可能性高于短壽命蛋白質(zhì)[23]。龍須菜gln2序列中也存在2個(gè)跨膜區(qū)及LCR，且3個(gè)區(qū)域均為龍須菜中特有。這些序列結(jié)構(gòu)可能是龍須菜在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的，使蛋白質(zhì)具有獨(dú)特的功能特征，如跨膜區(qū)可能使蛋白質(zhì)具有附于膜上的能力。

基于dld基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果印證了其分類關(guān)系，進(jìn)化樹中紅藻與雙子葉植物分為了2大類群，這說明在進(jìn)化過程中，紅藻與雙子葉植物產(chǎn)生了分歧，從而形成了2個(gè)進(jìn)化支，龍須菜處于紅藻進(jìn)化支中與臍形紫菜相近的位置。

啟動(dòng)子的調(diào)控在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中占有十分重要的地位，對(duì)dld、hsp15.4、gln2基因啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析，有助于探究3個(gè)基因的調(diào)控機(jī)理。植物啟動(dòng)子包括核心元件和一般上游元件，分析發(fā)現(xiàn)的dld、hsp15.4、gln2基因上游具有CAAT-box，這是絕大多數(shù)啟動(dòng)子正確啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的。CAAT-box一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前25～30 bp 的區(qū)域內(nèi)，是RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn)，保證轉(zhuǎn)錄的精確起始，并調(diào)控上游激活蛋白[24]。除了參與調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件，3個(gè)基因上游序列中還具有多種響應(yīng)元件，其表達(dá)可能受光照、激素和晝夜環(huán)境等影響。植物激素對(duì)紅藻生殖發(fā)育具有調(diào)控作用，如精胺具有促進(jìn)蜈蚣藻果胞成熟和釋放的作用[25-26]；乙烯能夠促進(jìn)翼枝菜的四分孢子囊成熟[27]。茉莉酸甲酯是一種環(huán)戊烷衍生型激素，能夠誘導(dǎo)生長相關(guān)基因的表達(dá)[28]。茉莉酸甲酯是具有明確抗逆作用的植物激素，能夠促進(jìn)龍須菜生長、提高體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量，同時(shí)能夠提高龍須菜抗高溫的能力[29]。

在眾多的啟動(dòng)子元件中，預(yù)測(cè)得到的光照刺激響應(yīng)元件最多。激素元件中，預(yù)測(cè)到茉莉酸甲酯響應(yīng)元件最多，其中dld有4處，gln2有6處，hsp15.4有4處；其次是脫落酸，均為2處。在龍須菜中，光照和茉莉酸甲酯可以調(diào)控龍瓊膠合成相關(guān)基因glgme、glmpg、glpmi和淀粉合酶基因glfss的表達(dá)，其中高光強(qiáng)可以促進(jìn)基因的表達(dá)，茉莉酸甲酯調(diào)控基因表達(dá)具有時(shí)間積累效應(yīng)[20]。說明在龍須菜中廣泛存在光照與茉莉酸甲酯調(diào)控因素。

本研究對(duì)啟動(dòng)子元件Light responsiveness、MeJA-responsiveness設(shè)置誘導(dǎo)條件并檢測(cè)其表達(dá)量，探究不同光照與茉莉酸甲酯是否可以調(diào)控dld、gln2、hsp15.4基因的表達(dá)。

不同光照條件誘導(dǎo)1和3 d時(shí)間，隨著光照強(qiáng)度增加，基因表達(dá)量均提高；無光條件下處理1 d，基因的表達(dá)量低于無光處理1 d的表達(dá)量，且不同光照強(qiáng)度下無光處理組基因的表達(dá)量均低于有光處理組，黑暗條件下會(huì)抑制基因的表達(dá)，說明光是調(diào)控3個(gè)育性控制相關(guān)基因表達(dá)的一個(gè)重要因素。正常光照處理下，隨著處理時(shí)間增加，基因表達(dá)量明顯增加；高光照處理下，隨著處理時(shí)間增加，基因表達(dá)量增加較少，說明高光照促進(jìn)基因表達(dá)的作用，隨時(shí)間增加而減弱。Zhou等通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)研究龍須菜四分孢子最佳放散及發(fā)育條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加光照強(qiáng)度和延長光照時(shí)長可以提高龍須菜四分孢子的放散數(shù)量以及發(fā)育速度，說明光照是調(diào)控龍須菜四分孢子體育性的環(huán)境因素之一[17]。

通過不同濃度的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著濃度和處理時(shí)間增加，dld、gln2、hsp15.4基因表達(dá)量均增加，說明茉莉酸甲酯也是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。低濃度的茉莉酸甲酯(100 μmol/L)在誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到1 h后可以使3個(gè)基因的表達(dá)量顯著增加。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，外源茉莉酸甲酯可參與調(diào)控紅藻的育性性狀表達(dá)[18]。Garcia-Jimenez等使用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)培養(yǎng)紅藻Gratelopiaimbricata和Pterocladiellacapillacea，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其生殖結(jié)構(gòu)的數(shù)量增多；觀察Grateloupiaimbricate的囊果數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明茉莉酸甲酯處理后的藻體產(chǎn)生囊果數(shù)量較對(duì)照組顯著增多，且成熟周期縮短，放散量增加[18]。

本研究通過對(duì)龍須菜四分孢子體不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因的分析，得到了與育性控制相關(guān)的基因dld、gln2、hsp15.4，完成了dld基因的克隆及3個(gè)基因的刺激響應(yīng)研究，為闡明龍須菜育性控制機(jī)理和通過外部條件調(diào)控基因表達(dá)及藻體發(fā)育提供了可能。