細條天竺鯛群體線粒體DNA控制區(qū)序列比較分析?

方潤東， 宋 娜， 周永東， 李鵬飛， 高天翔

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003; 2. 浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江 舟山 316021； 3. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021； 4. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316021)

細條天竺鯛(Apogonlineatus)屬鱸形目(Perciformes)、天竺鯛科(Apogonidae)、天竺鯛屬(Apogon)，主要分布于中國的黃渤海和東海，臺灣及南海亦有分布[1-4]，為底棲性小型魚類，多棲息于泥砂質(zhì)海底，為常見的小型魚類，是一些食肉型經(jīng)濟種類的重要食物來源。細條天竺鯛常棲息于近岸中下層，磷蝦、十足類和端足類是其主要攝食的對象[5]。由于細條天竺鯛很少被食用、沒有任何直接的經(jīng)濟價值，和眾多小型魚類一樣，并未受到足夠重視。小型魚類既是食肉型經(jīng)濟魚種捕食的對象，又可以攝食其他魚類產(chǎn)的卵，可以在一定程度上調(diào)控某些經(jīng)濟魚類的種群規(guī)模[6]。因此隨著當(dāng)前漁獲物組成的明顯改變，這類小魚對于維持海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈正常有序的能量流動和物質(zhì)交換具有不可替代的重要作用[6-8]。因此，開展對細條天竺鯛種質(zhì)資源狀況及現(xiàn)有遺傳豐富度的調(diào)查研究，能夠正確了解并有效保護這一重要的海洋魚類。迄今為止，有關(guān)細條天竺鯛的研究僅僅局限于耳石形態(tài)、食性、資源分布及生態(tài)價值等基礎(chǔ)工作[9-13]。雖然細條天竺鯛具有較高的生態(tài)價值，但尚未見其群體遺傳學(xué)方面的研究報道。

為了實現(xiàn)漁業(yè)資源開發(fā)的可持續(xù)性，需要建立有效的漁業(yè)管理制度。根據(jù)群體建立不同的單元可提高漁業(yè)管理效率，而群體遺傳結(jié)構(gòu)對漁業(yè)管理單元的劃分具有關(guān)鍵作用[14]。線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)作為分子標(biāo)記對檢測群體遺傳結(jié)構(gòu)非常敏感，而且線粒體DNA呈母性遺傳且不發(fā)生重組，其中控制區(qū)進化速度較快，是研究遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)較為理想的工具[15-17]。目前利用mtDNA控制區(qū)基因檢測海洋生物遺傳多樣度組成及群體遺傳特征已成為顯著有效的方法，曾先后被應(yīng)用于日本鳀(Engraulisjaponicus)、斑尾復(fù)蝦虎魚(Synechogobiusommaturus)、香魚(Plecoglossusaltivelis)[18-20]等海水魚的遺傳豐富度和遺傳特征的探討。除此以外，核苷酸序列中的變異個數(shù)和分布方式能幫助我們推測魚類種群的進化歷程，進而探討產(chǎn)生和維持這些多態(tài)的機制[19]。進入更新世冰期后，全球劇烈的氣候波動導(dǎo)致海平面下降，海洋環(huán)境變化明顯[21]。海洋魚類適宜的棲息環(huán)境大量減少導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降，幸存下來的個體集中到避難所。冰期過后，氣溫的回升使海平面回升到之前高度，幸存者在度過冰期后由原有避難所重新移殖到其他適宜生存的環(huán)境中[22]。由此可認為冰期氣候波動對海洋環(huán)境的改變深刻影響到海洋魚類的群體遺傳特征[23]。本研究利用mtDNA控制區(qū)序列檢測細條天竺鯛群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，探討影響其種群遺傳結(jié)構(gòu)形成和變化的因素，從而為保護細條天竺鯛現(xiàn)有生物資源及適度的開發(fā)利用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

本研究所用的細條天竺鯛群體分別采自威海乳山、青島膠南、上海以及舟山近海海域，共114尾細條天竺鯛個體，基本覆蓋了中國沿海細條天竺鯛的主要分布范圍(黃渤海到東海，見表1、圖1)。物種的鑒定依據(jù)Mabuchi等[4]。

表1 細條天竺鯛的采樣信息以及一些遺傳多樣性指數(shù)Table 1 Sample information of Apogon lineatus including several genetic diversity indices

圖1 細條天竺鯛的采樣地點Fig.1 Sampling location of Apogon lineatus

1.2 DNA提取與目的片段擴增

剪取樣本一小塊背部肌肉，并采用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿法提取基因組DNA。擴增所用引物為控制區(qū)通用引物[19]，正向序列為5’-CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3’，反向序列為5’-CTGGAAAGAACG-CCCGGCATG-3’。

PCR反應(yīng)在體系包括： 1 μL DNA模板，17.25 μL去離子水，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL的dNTPs，0.15 μL Taq聚合酶，正反向引物物各1 μL。熱反應(yīng)循環(huán)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 共35次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。為防止樣品污染，每次試驗均設(shè)置陰性對照。將純化、回收后的PCR產(chǎn)物送到上海桑尼生物技術(shù)有限公司，采用ABIPrism3700自動測序儀雙向測通產(chǎn)物序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Dnastar 軟件包下的Seqman軟件對測序結(jié)果進行比對分析并加以校正；遺傳多樣性指數(shù)計算在ARLEQUIN 3.11軟件上完成[24]。遺傳多樣性指數(shù)包括：單倍型多樣度(Haplotype diversity)，群體多態(tài)位點數(shù)(No of polymorphic sites)，核苷酸多樣度(Nucleotide diversity)和平均兩兩堿基差異數(shù)(Mean pairwise nucleotide differences)。計算單倍型之間的關(guān)系和核苷酸之間的差異數(shù)，并手工構(gòu)建分支網(wǎng)絡(luò)樹。以斑鰭天竺鯛(Apogoncarinatus)為外群，使用Mega3.0軟件基于K2P模型構(gòu)建系統(tǒng)樹。

使用群體間分化指數(shù)Fst值衡量兩兩群體間遺傳分化程度[25]。在計算兩兩群體間Fst值時，進行10 000次重抽樣檢測其顯著性。當(dāng)進行多重比較時，在Excel中使用Bonferroni方法校準(zhǔn)P值[26]。采用確切P檢驗，檢查不同群體間能否發(fā)生隨機交配。

核苷酸不配對分布分析和中性檢驗用來檢測細條天竺鯛群體歷史動態(tài)。中性檢驗包括Tajima’sD檢驗[27]和Fu’Fs檢驗[28]。D值和Fs為顯著的負值，通常表明群體經(jīng)歷過擴張事件。核苷酸不配對分布分析同樣用來檢測是否存在群體擴張[29]。使用廣義非線性最小方差法估算群體擴張時間τ值和群體擴張參數(shù)θ0，θ1。τ值是用突變單位表示的群體擴張的時間。利用公式τ=2ut可把τ值換算成真實的擴張時間，其中t為群體擴張實際經(jīng)歷的時間，u為整個基因片段的變異速度。θ0代表擴張前的群體擴張參數(shù) ，θ1反之。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

細條天竺鯛所有個體經(jīng)PCR擴增后獲得長504 bp的目的片段。對所有測序得到的原始序列進行比對校正、剔除轉(zhuǎn)運RNA后，獲得4個群體共114個個體長度為476 bp的控制區(qū)第一高變區(qū)序列，作為用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的目的序列。在所有目的序列中發(fā)現(xiàn)10處簡約信息位點和26處變異位點，其中轉(zhuǎn)換23處，顛換3處。4種堿基在目的序列中占比分別為：A為32.39%，C為18.62%，G為17.19%，T為31.80%， A+T占比(64.19%)高出C+G占比(35.81%)很多，表現(xiàn)為AT偏好。細條天竺鯛控制區(qū)A+T含量較高，與其他海洋魚類控制區(qū)A+T占比高，C+G占比低的特征類似。除此之外，114條控制區(qū)序列共包含了30個單倍型，其中僅有4個單倍型被不同群體共享，其余26個均為各群體所獨有(見表2)。綜合單倍型多樣度及核苷酸多樣度來看，上海和舟山群體的遺傳多樣性高于乳山和膠南群體的遺傳多樣性。

表2 細條天竺鯛4個地理群體的單倍型分布Table 2 Haplotypes in four Apogon lineatus populations

續(xù)表2

單倍型Haplotypes乳山(RS)膠南(JN)上海(SH)舟山(ZS)Hap 180010Hap 210010Hap 220010Hap 230010Hap 240001Hap 250001Hap 260001Hap 270001Hap 280001Hap 290001Hap 300001

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

以斑鰭天竺鯛為外群，利用30個細條天竺鯛控制區(qū)單倍型構(gòu)造鄰接關(guān)系樹(Neighbor-joining tree，NJ樹)，結(jié)果表明不同群體的單倍型均無規(guī)律地散布到單倍型NJ樹上。不存在與地理群體顯著對應(yīng)的系統(tǒng)分支，由此我們認為細條天竺鯛不同地理群體間并無顯著的譜系結(jié)構(gòu)。細條天竺鯛與斑鰭天竺鯛遺傳差異顯著(見圖2)。

(比例尺為0.01，代表遺傳距離遠近，分支處數(shù)字為超過50%的自展支持率。Scale bar=0.01 substitutios per site. Numbers at notes are bootstrap values.The numbers lower than 50% are not shown.)

圖2 基于細條天竺鯛30個控制區(qū)單倍型構(gòu)建的鄰接關(guān)系樹， 所用外群為斑鰭天竺鯛A.carinatus
Fig.2 NJ tree forA.lineatusbased on 30 haplotypes with an outgroupA.carinatus

由30個單倍型構(gòu)成的分支網(wǎng)絡(luò)樹(見圖3)，其分支結(jié)構(gòu)與NJ樹的構(gòu)造相類似，沒有發(fā)現(xiàn)某一單倍型分支都來自同一地理群體的現(xiàn)象。分支網(wǎng)絡(luò)樹的構(gòu)造為星爆形，由此可推測細條天竺鯛群體歷史上曾發(fā)生擴張事件。

細條天竺鯛兩兩群體間Fst值的范圍為-0.015到0.067(見表3)，并且不同群體間遺傳差異都不顯著(經(jīng)校正的P值大于0.05)，同時確切P檢驗的分析提示隨機交配現(xiàn)象廣泛存在于這4個群體之間。

圖3 細條天竺鯛控制區(qū)單倍型分支網(wǎng)絡(luò)樹Fig.3 Minimum spanning trees showing genetics relationship in A. lineatus

乳山(RS)膠南(JN)上海(SH)舟山(ZS)乳山(RS)—0.8660.0200.117膠南(JN)0.017—0.0110.045上海(SH)0.0340.067—0.607舟山(ZS)0.0180.062-0.015—

2.3 群體歷史動態(tài)

較低的核苷酸多樣度和單倍型分支網(wǎng)絡(luò)樹的星爆形構(gòu)造，暗示了細條天竺鯛群體歷史上可能發(fā)生過擴張事件。核苷酸不配對分布分析的結(jié)果(見圖4)表明，細條天竺鯛核苷酸不配對分布表現(xiàn)為近正態(tài)分布單峰形，同時觀測值的分布與群體擴張模型預(yù)期分布較好地重合。利用中性檢驗對這一推測進行驗證(見表4)，Tajima’sD值和FS值均小于0，并且所有群體的統(tǒng)計檢驗顯著(P<0.05)。因此綜合以上兩種方法的驗證，我們認為細條天竺鯛群體歷史上發(fā)生過擴張事件。

圖4 細條天竺鯛控制區(qū)單倍型核苷酸不配對分布Fig.4 Mismatch distributions of control region haplotypes of A. lineatus

τ值(圖4中的峰值)是用突變單位表示的群體擴張的時間，利用公式τ=2ut可換算成真實的擴張時間t，其中u為整個基因片段的變異速度。本研究根據(jù)5%～10%/MY的控制區(qū)分歧速率和τ值2.973，估算出細條天竺鯛的群體擴張時間大約為62 450～124 900 a前，處于更新世晚期。

3 討論

具有較高遺傳多樣性的物種，生存能力和對環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強[30]。對物種遺傳多樣性的研究可以幫助預(yù)測物種的發(fā)展動向和分析物種的進化潛力。

表4 細條天竺鯛群體Tajima’s D、Fu’Fs統(tǒng)計值和核苷酸不配對分布分析結(jié)果Table 4 Tajima’s D, Fu’Fs and mismatch distribution parameter of A. lineatus

本研究中，細條天竺鯛作為其分布區(qū)主要小型魚類優(yōu)勢種和肉食性經(jīng)濟魚類的重要餌料魚種，與已研究報道的魚類相比其遺傳多樣性屬于中等偏低的水平[19-20]。鑒于高有效種群尺度是維持物種高水平遺傳多樣性的原因[31]，有效種群較小是造成其低遺傳多樣性的重要原因，細條天竺鯛資源量可能較少，因此其資源狀況需要引起漁業(yè)資源管理部門的重視。

海洋生態(tài)系統(tǒng)由于其開放性缺乏明顯的地理和物理障礙，并且廣泛存在的洋流運動能夠使魚卵、幼體和成魚擴散到更遠的范圍。海洋魚類群體間的基因交流一般不會因為地理距離增大而中斷，這保證了不同地理群體仍有相似的遺傳結(jié)構(gòu)[31-34]。Fst值又稱群體分化指數(shù)，用來描述群體間遺傳差異大小，差異越大則該值越大，反之越小。細條天竺鯛4個群體的遺傳分化指數(shù)Fst值介于-0.015～0.067之間，同時統(tǒng)計檢驗不顯著，因此可以判斷不同地理群體間遺傳結(jié)構(gòu)非常相近。本研究通過對細條天竺鯛線粒體DNA控制區(qū)序列分析，表明細條天竺鯛分布在我國黃海和東海的4個群體間沒有明顯的地理分化，可能是由一個大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過長期進化而來。出現(xiàn)這種情況的原因可能是：乳山海域到舟山海域之間不存在影響細條天竺鯛基因交流的明顯地理障礙，雖然細條天竺鯛成體不作長距離遷移，但是其漂浮卵、浮游幼體和成體都可能因為中國沿岸流活動而擴散較遠的距離[21,35]。我國近海的黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)和臺灣海峽的斑鰶(Konosiruspunctatus)等也被證實在較大區(qū)域內(nèi)沒有明顯的地理分化[36-37]。

更新世全球氣候波動表現(xiàn)為冰期和間冰期相互更迭。以大概10萬a為一次間隔，這樣的氣候更替持續(xù)了80萬a，海平面也隨之發(fā)生升降[38]。第四紀(jì)末冰盛期，海平面下降了120～140 m，細條天竺鯛的群體數(shù)量和分布受到了巨大影響，適宜其棲息的環(huán)境大量消失導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降，幸存下來的個體集中在避難所。冰期過后，氣溫的回升使海平面回升到之前高度，細條天竺鯛在度過冰期后由原有避難所重新移殖到其他適宜生存的環(huán)境中，之前孤立的種群也隨著隔離海域的重新連接開始逐漸交流[39-40]。細條天竺鯛上海、舟山群體的單倍型多樣度及核苷酸多樣度顯著高于乳山、膠南群體，我們推測可能是因為中國東海海盆是其在更新世冰期的避難所之一[18]。核苷酸不配對分布在經(jīng)歷過近期群體擴張事件的群體中一般會呈現(xiàn)明顯的單峰分布[29,41]。核苷酸不配對分布的結(jié)果提示細條天竺鯛發(fā)生了群體擴張，Tajima’sD值和FS值均小于0，并且所有群體的統(tǒng)計檢驗顯著(P<0.05)，亦驗證了這一推測。我們將5%～10%/MY的控制區(qū)分歧速率用于細條天竺鯛控制區(qū)，得出其群體擴張事件大約發(fā)生在在62 450～124 900年前，屬于晚更新世冰期。由此可以推測細條天竺鯛的群體擴張事件與更新世氣候的波動有關(guān)。

本研究涉及的地理群體只有乳山、膠南、上海和舟山共4個群體，而鑒于細條天竺鯛在我國是分布于黃渤海及東海的常見小型魚類，因此想要探討細條天竺鯛在中國沿海分布范圍內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)我們還需要分析更多的群體以及樣本并利用包括核基因等分子標(biāo)記方法，以期更好地了解這一物種的遺傳分化，為評估其資源狀況及在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的價值提供科學(xué)依據(jù)。