擬南芥和水稻Cel基因家族的生物信息學(xué)分析

王麗珊

（閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 龍巖 364021）

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分。纖維素酶解是將生物質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為乙醇的一條高效的、無(wú)污染的關(guān)鍵途徑。研究纖維素酶對(duì)解決世界糧食短缺、能源危機(jī)、環(huán)境污染等問(wèn)題具有重要意義。植物合成的纖維素酶（Cellulase，Cel），通常也稱內(nèi)切-1,4-β-葡 聚 糖 酶 （endo-1,4-β-D-glucanases，EC 3.2.1.4），屬于糖苷水解酶家族9（glycoside hydrolase family 9，GH9），在纖維素的合成和分解過(guò)程中起著重要的作用[1]。Hayashi等鑒定了25個(gè)擬南芥Cel基因和20個(gè)水稻Cel基因[2]。研究表明纖維素酶與擬南芥長(zhǎng)角果開(kāi)裂和楊樹(shù)側(cè)根生成有關(guān)[3-4]。目前已有多種植物Cel基因相繼報(bào)道，但對(duì)雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻Cel基因的對(duì)比分析報(bào)道較少。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，對(duì)擬南芥和水稻Cel基因的基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽（signal peptide，SP）、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)和對(duì)比分析，以期為今后深入研究植物Cel基因家族的進(jìn)化、結(jié)構(gòu)特征和功能的多樣性提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文數(shù)據(jù)來(lái)自于擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR、水稻數(shù)據(jù)庫(kù)RGAP、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)CAZY、植物信息資源網(wǎng)Phytozome、美國(guó)國(guó)立生物信息中心NCBI、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室EMBL。

1.2 方法

1.2.1 Cel基因家族成員的鑒定與分類、基因結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

以擬南芥和水稻Cel基因編碼蛋白質(zhì)序列為檢索序列，利用BLAST工具進(jìn)行同源搜索。運(yùn)用軟件Pfam、CDD、SMART等預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，具有GH9催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列屬于纖維素酶。將結(jié)構(gòu)域特征進(jìn)行比對(duì)分析后分類和命名。運(yùn)用軟件GSDS對(duì)Cel基因的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子和外顯子位置和數(shù)量進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。運(yùn)用軟件BioEdit、Clustal W、MEGA7．0 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多重比對(duì)、聚類分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 Cel基因家族成員蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)特性分析

運(yùn)用軟件PROTPARAM、PROTSCALE對(duì)Cel基因編碼蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)等）進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。運(yùn)用軟件SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。運(yùn)用軟件Swiss-Model對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，Swiss-PdbViever分析同源建模的結(jié)果，并構(gòu)建拉氏圖。拉氏圖中二面角有90%以上位于允許區(qū)和最大允許區(qū)，則表明構(gòu)建的空間構(gòu)象是合理的。

1.2.3 Cel基因家族成員蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、保守基序和多序列比對(duì)分析

運(yùn) 用 軟 件 TMHMM、SIGNALP、PSORT、Plant-PLoc對(duì)Cel基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)、SP及亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。運(yùn)用軟件Pfam、CDD、SMART、Prosite對(duì)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。運(yùn)用軟件MEME對(duì)蛋白質(zhì)的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。運(yùn)用Clustal W對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cel基因家族成員的鑒定與分類、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和基因結(jié)構(gòu)分析

從擬南芥和水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中分別搜索到各25個(gè)Cel基因，數(shù)目差別不大。Urbanowicz將GH9分為3個(gè)亞家族：GH9A、GH9B、GH9C[5]。GH9A 成員的蛋白質(zhì)N端具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（cytosolic domain，CT）和跨膜結(jié)構(gòu)域 （transmembrane domain，TM），C 端具有GH9催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain,CD）。GH9B成員的蛋白質(zhì)N端具有SP，C端具有CD。GH9C成員的蛋白質(zhì)N端具有SP和CD，C端具有CBM和連接肽。參照該分類方法，對(duì)50個(gè)Cel基因進(jìn)行分類和命名。擬南芥GH9A有4個(gè)成員，GH9B有18個(gè)成員，GH9C有3個(gè)成員；水稻GH9A有4個(gè)成員，GH9B有17個(gè)成員，GH9C有4個(gè)成員（表1，篇幅有限僅展示部分成員）。

由圖1可知，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中擬南芥和水稻沒(méi)有單獨(dú)聚類形成各自的分支，而是相互交叉，3個(gè)亞家族沒(méi)有明顯地分為3大支。Cel基因分成4大類群：Ⅰ類群有21個(gè)成員，均是GH9B成員；Ⅱ類群有18個(gè)成員，是GH9B和GH9C成員；Ⅲ類群有6個(gè)成員，均是GH9A成員；Ⅳ類群有5個(gè)成員，均是GH9B成員。GH9B既能與GH9A聚成一支，又能與GH9C聚成一支。Cel基因家族中出現(xiàn)較多的旁系同源蛋白，其中GH9B旁系同源蛋白數(shù)量最多。擬南芥和水稻Cel基因結(jié)構(gòu)差異很大，具有十分明顯的多樣性特征。擬南芥中，大部分Cel基因有3～7個(gè)內(nèi)含子（92%）。水稻中，大部分Cel基因有2～6個(gè)內(nèi)含子（88%）。GH9A成員的內(nèi)含子數(shù)量多于GH9C成員。GH9A成員中，AtGH9A2和OsGH9A3發(fā)生了內(nèi)含子丟失，其余Cel基因結(jié)構(gòu)相似。GH9C成員中，OsGH9C1、OsGH9C2、OsGH9C4發(fā)生了內(nèi)含子丟失，其余Cel基因結(jié)構(gòu)相似。GH9B成員中，擬南芥和水稻的Cel基因結(jié)構(gòu)差異較大。由表1可知，Cel基因在染色體上分布并不均勻。擬南芥中，第1號(hào)染色體上分布最多；水稻中，第2號(hào)染色體上分布最多。水稻的基因長(zhǎng)度比擬南芥略長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度、編碼基因長(zhǎng)度和肽鏈氨基酸個(gè)數(shù)差別不大。

2.2 Cel基因家族成員蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由表1可知，Cel基因編碼的蛋白質(zhì)分子量相近， 擬南芥在 52．5～69．8kDa 之間， 水稻在 41．5～69．2kDa 之間（OsGH9C3 除外）。Cel基因編碼的蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)（PI）大小不等，擬南芥PI最高為9．33，最低為 5．03；水稻 PI最高為 9．36，最低為 5．2。不穩(wěn)定系數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白，小于40為穩(wěn)定蛋白，大部分Cel基因編碼的蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白（92%）。 親水性指數(shù)介于-0．5～0．5 之間為兩性蛋白質(zhì)[6]，Cel基因編碼的蛋白質(zhì)均為兩性蛋白質(zhì)。Cel基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本相似（AtGH9B8和OsGH9C4除外），主要結(jié)構(gòu)元件是無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋，特征為無(wú)規(guī)則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-轉(zhuǎn)角。Cel基因編碼的蛋白質(zhì)序列三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模結(jié)果顯示，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是主要結(jié)構(gòu)，拉氏圖顯示空間構(gòu)象合理（圖略）。

2.3 Cel基因家族成員蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位分析

由表1可知，GH9A和GH9C成員均具有1個(gè)跨膜螺旋；GH9B大部分成員不具有跨膜螺旋（擬南芥67%、水稻59%）。GH9A成員均不具有SP（Os－GH9A4除外）；GH9C成員均具有SP（OsGH9C4除外）；GH9B大部分成員具有SP（擬南芥83%，水稻82%）。擬南芥和水稻的13個(gè)Cel基因編碼的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜 （26%）、3個(gè)定位于細(xì)胞壁（6%）、34個(gè)定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁（68%）。

2.4 Cel基因家族成員蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、保守基序和多序列比對(duì)分析

由表1可知，Cel基因編碼的蛋白質(zhì)均有CD，大部分成員在CD內(nèi)有1個(gè)DAGD氨基酸模塊（92%）。其中OsGH9B17沒(méi)有DAGD模塊，AtGH9A2為DGGS模塊，OsGH9B7、OsGH9C4為GSDG模塊。GH9A成員的蛋白質(zhì)N端均有TM （位于71~101氨基酸殘基片段上），沒(méi)有SP（OsGH9A4除外）；C端有脯氨酸富集區(qū)域 （最后16個(gè)氨基酸中有8~10個(gè)脯氨酸）。GH9B少部分成員具有TM，且位置不一樣。GH9C成員的蛋白質(zhì)N端均有TM （位于7~29的氨基酸殘基片段上）和SP；C端均有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM49）。GH9具有2個(gè)催化活性位點(diǎn)特征（active sites signature）：特征 1 具有[STV]-x-[LIVMFY]-[STV]-x（2）-G-x-[NKR]-x（4）-[PLIVM]-H-x-R 序列；特征 2 具有[FYW]-x-D-x（4）-[FYW]-x（3）-E-x-[STA]-x（3）-N-[STA]序列[5]。 19 個(gè) Cel基因編碼的蛋白質(zhì)同時(shí)有催化活性位點(diǎn)特征1和2（38%）。大部分只有特征1的成員，有RGD模塊。由圖2可知，共鑒定出了25個(gè)保守基序（motif 1~25），這些保守基序形成了多樣性和復(fù)雜性的組成模式。最大基序長(zhǎng)度為49個(gè)氨基酸，最小基序長(zhǎng)度僅為8個(gè)氨基酸。motif 1~19、motif 22出現(xiàn)在較多數(shù)Cel基因編碼的蛋白質(zhì)中，且出現(xiàn)在CD內(nèi)。GH9A成員特有基序?yàn)?motif 20、motif 21、motif 23、motif 25。GH9C 成員特有基序?yàn)閙otif24。GH9B成員具有多樣化的組成模式。保守結(jié)構(gòu)域與模塊預(yù)測(cè)的位置基本一致 （圖略）。motif 2在微生物有發(fā)現(xiàn)，且較保守，通常第1個(gè)酪氨酸被色氨酸取代，其中DAGD模塊可能與金屬結(jié)合有關(guān)；motif 3和motif 9，只存在于植物的葡聚糖酶中，微生物中沒(méi)有；motif 7在植物和微生物中均有；motif 1和motif 4分別是GH9的2個(gè)催化活性位點(diǎn)所在區(qū)域，且相對(duì)保守；motif 14是RGD模塊所在區(qū)域；motif 21是脯氨酸富集區(qū)域；motif 24是CBM所在區(qū)域；motif 20是CT所在區(qū)域[5]。

圖1 擬南芥和水稻Cel基因家族基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

利用現(xiàn)有的擬南芥和水稻生物信息資源，各鑒定出25個(gè)Cel基因，其數(shù)目上相差不大，說(shuō)明Cel基因家族在不同植物中進(jìn)化是相對(duì)保守的。從系統(tǒng)進(jìn)化分析，擬南芥和水稻Cel基因沒(méi)有單獨(dú)聚類，說(shuō)明在單雙子葉植物分化前，Cel基因發(fā)生過(guò)大幅度擴(kuò)張。Cel基因家族具有較多的旁系同源蛋白，說(shuō)明在單雙子葉植物分化后，Cel基因家族許多成員獲得了新功能，同時(shí)產(chǎn)生許多假基因。其中GH9B旁系同源蛋白數(shù)量最多。3個(gè)亞家族沒(méi)有明顯地分為3大支，這可能與糖苷水解酶結(jié)構(gòu)域的保守性有關(guān)。GH9B既能與GH9A聚為一支，又能與GH9C聚成一支，說(shuō)明GH9B在結(jié)構(gòu)上與GH9A和GH9C具有共同點(diǎn)（CD，SP），與結(jié)構(gòu)域分析相吻合。

圖2 擬南芥和水稻Cel基因家族保守模塊預(yù)測(cè)

從基因結(jié)構(gòu)看，擬南芥和水稻Cel基因在染色體上的分布比較散，基因結(jié)構(gòu)差異大，說(shuō)明Cel基因具有明顯的多樣性特征，有復(fù)雜的起源和進(jìn)化歷史。GH9A成員的內(nèi)含子數(shù)量多于GH9C成員，說(shuō)明GH9A成員在進(jìn)化過(guò)程中插入不少內(nèi)含子，使其功能更為特化，產(chǎn)生的時(shí)間較晚。由此推測(cè)，GH9C是GH9A和GH9B的祖先，GH9A屬于進(jìn)化過(guò)程中較新的亞家族。GH9A和GH9C成員中，擬南芥和水稻的Cel基因結(jié)構(gòu)相似，說(shuō)明在單子葉植物和雙子葉植物中，GH9A和GH9C功能進(jìn)化較保守。AtGH9A2、OsGH9A3是GH9A中較早出現(xiàn)的成員。OsGH9C1~2、OsGH9C4是GH9C中較早出現(xiàn)的成員，且都是水稻的Cel基因，表明單子葉植物的GH9C出現(xiàn)的時(shí)間較早。

從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)看，擬南芥和水稻Cel基因編碼的蛋白質(zhì)分子量相近，理論等電點(diǎn)大小不等，均為兩性蛋白，大部分成員為穩(wěn)定蛋白質(zhì)（82%），二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)基本相似，說(shuō)明纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能緊密相聯(lián)。GH9A和GH9C成員均具有1個(gè)跨膜螺旋，GH9B大部分成員不具有跨膜螺旋，說(shuō)明GH9A、GH9C全部成員和GH9B少部分成員，需要經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)錨定于生物膜，才能發(fā)揮生物學(xué)作用。GH9A成員均不具有SP，GH9C成員和GH9B大部分具有SP，說(shuō)明GH9A成員均為非分泌蛋白，GH9C成員和GH9B大部分成員為分泌蛋白。亞細(xì)胞定位顯示纖維素酶位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，說(shuō)明蛋白質(zhì)合成后，需經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁后才能發(fā)揮催化作用。

從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和保守基序看，纖維素酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域與保守基序位置一致。Cel基因編碼的蛋白質(zhì)均具有 CD，CD內(nèi)有一個(gè) DAGD模塊（motif 2）。其中 OsGH9B7、OsGH9C4 為 GSDG 模塊，因此推測(cè)GSDG模塊可能只出現(xiàn)在單子葉植物中，這個(gè)位點(diǎn)上的基因突變是否對(duì)其功能造成影響，有待進(jìn)一步研究。GH9A成員的蛋白質(zhì)N端有TM和CT（motif 20），C 端有脯氨酸富集區(qū)（motif 21），這個(gè)特點(diǎn)與微生物的連接不同結(jié)構(gòu)域的連接肽結(jié)構(gòu)相似。GH9C成員的蛋白質(zhì)N端均有TM和SP，C端均有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM49，motif 24）。 GH9B 少部分成員具有TM。Cel基因家族少部分成員同時(shí)具有催化活性位點(diǎn)特征1和2（motif 1，motif 4）。只有特征1的大部分成員，其蛋白質(zhì)都具有RGD模塊（motif 20），推測(cè)與細(xì)胞附著有關(guān)[7-8]。 motif 23和motif 25的功能有待進(jìn)一步研究分析。motif 20、motif 21、motif 23、motif24、motif 25 屬于稀少基序，表現(xiàn)出不同亞家族特異性，說(shuō)明這些保守基序可能參與亞家族蛋白功能的形成，是決定亞家族功能的關(guān)鍵保守基序。