國標法測定魚肉中組胺的方法改進

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(海南省食品檢驗檢測中心,海南?？?570000)

組織胺(Histamine)是由組氨酸脫羧酶(Histidine decarboxylase,HDC)催化L-組氨酸脫羧生成的一種重要生理活性物質(zhì),是一種廣泛存在于人體組織中的活性胺化合物。作為身體內(nèi)的一種化學(xué)傳導(dǎo)物質(zhì),可以影響許多細胞的反應(yīng),包括過敏、炎性反應(yīng)、胃酸分泌等,也可以影響腦部神經(jīng)傳導(dǎo)[1]。魚體內(nèi)含有較多的組氨酸,當(dāng)魚體不新鮮或者發(fā)生腐敗時,污染魚體的細菌如組胺無色桿菌,就會產(chǎn)生脫羧酶,使組氨酸脫羧生成組胺。如果攝入的組胺超過人體的忍受范圍,就會引發(fā)過敏性中毒;發(fā)生組胺中毒時,人體會產(chǎn)生局部或全身毛細管擴張、支氣管收縮等現(xiàn)象,主要癥狀為臉紅、頭暈、心慌、胸悶和呼吸窘迫等,部分病人還會有眼結(jié)膜充血、瞳孔散大、視物模糊、臉發(fā)漲、口舌及四肢發(fā)麻、惡心、嘔吐腹瀉、尋麻疹、全身潮紅、血壓下降等不良反應(yīng)[2-3]。國內(nèi)也時有組胺中毒事件發(fā)生,2010年4月張家港市某公司15名職員因食用變質(zhì)青占魚引起組胺中毒[4],2014年8月浙江省寧海縣某公司部分職工因食用鮐魚而出現(xiàn)組胺中毒現(xiàn)象[5]等。因此,需要對組胺進行科學(xué)測定及監(jiān)控。

水產(chǎn)品中組胺的測定方法有高效液相色譜法、薄層層析法、生物學(xué)法、分光光度法等[6]。近年來,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)及毛細管電泳等方法也被用來進行組胺的檢測。高效液相色譜法根據(jù)衍生方式不同,可分為柱前衍生法和柱后衍生法,檢測靈敏度高,分析準確,適合于大批量樣品的組胺含量測定,但成本高[7];薄層色譜法設(shè)備簡單,操作容易,但相比于高效液相色譜法其靈敏度較低[8];生物化學(xué)法主要利用氧化酶與組胺反應(yīng)生成過氧化氫,通過測定生成物含量確定組胺濃度,方法選擇性強,靈敏度高,但存在生物固化膜不穩(wěn)定等缺點[9]。

目前,我國測定魚類中組胺的方法為國標法GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》,其中第二法分光光度法具有不需要貴重儀器、成本低等優(yōu)點,但操作步驟復(fù)雜繁瑣,提取效率低,重復(fù)性較差。本文在國標法第二法的基礎(chǔ)上,通過研究改進提取方法及簡化萃取步驟等方式,以期獲得更為精確有效的組胺提取測定方法,為今后組胺新標準方法的建立提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮帶魚、海鰻魚、秋刀魚、馬鮫魚、黃花魚、紅線魚、金昌魚、沙丁魚 海南地區(qū)超市或農(nóng)貿(mào)市場;三氯乙酸、正戊醇 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、亞硝酸鈉 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;對硝基苯胺 分析純,美國阿拉丁工業(yè)公司;二磷酸組胺 純度>98.0%,上海安譜實驗科技股份有限公司。

FW135樣品粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;數(shù)顯多位渦旋混勻器 德國海道爾夫集團;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州翔天實驗儀器廠;MS1602S電子分析天平 梅特勒-托利多(常州)精密儀器有限公司;Mili-Q A10超純水機 密理博中國有限公司;SK7200B超聲波清洗機 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將市售新鮮魚(為保證改進法普遍適用于大多數(shù)魚類,方法改進中樣品選擇為隨機選取海南地區(qū)常見可食用魚,見1.1)宰殺,除去不可食用的魚頭、內(nèi)臟及魚刺部分,用自來水清洗并瀝干水分,使用樣品粉碎機絞碎至勻漿狀態(tài),備用。

1.2.2 方法改進 對國標法GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中第二法分光光度法進行方法改進。

1.2.2.1 甲液的改進 對硝基苯胺難以在鹽酸(1+11)溶液中完全溶解,進行長時間多次振蕩、超聲、加熱,仍有大量對硝基苯胺呈固態(tài)無法溶解,導(dǎo)致標準曲線顯色過淺且不成系列,上機測試后所得標準曲線線性較差。改變后甲液的配制步驟為:稱取0.5 g對硝基苯胺,加5 mL濃鹽酸溶解后,混勻超聲(60 W,20 ℃)5 min,使對硝基苯胺完全溶解,再加水稀釋至200 mL。使用該甲液,其他操作參考國標法第12.2.2條,配制標準曲線,測定其相關(guān)性。

1.2.2.2 三氯乙酸浸提條件的改進 隨機取市售新鮮沙丁魚、秋刀魚、紅線魚、黃花魚、金昌魚為樣品,準確稱取1.2.1中魚肉糜10.00 g,置于50 mL聚四氟乙烯離心管中,加入20 mL三氯乙酸溶液(100 g/L)后,放入60 ℃水浴鍋中保溫0.5 h進行浸提[10]。浸提后試樣參照國標方法第12.2條操作進行分析測定,將國標法測定組胺含量與改進法進行對比。

1.2.2.3 正戊醇和鹽酸提取方式的改進 隨機取市售新鮮馬鮫魚、帶魚、紅線魚為樣品,對按1.2.2.2中方法浸提得到的濾液進行萃取凈化。將離心管振蕩2 min混勻,濾紙過濾,準確吸取2.0 mL濾液置于15 mL離心管中,逐滴加入氫氧化鈉溶液(250 g/L)調(diào)節(jié)pH10～12(使用pH試紙控制酸堿度),加入3 mL正戊醇,渦旋振搖提取5 min,靜置分層,用潔凈吸管提取正戊醇提取液(上層),重復(fù)提取并合并提取液,用正戊醇定容至10 mL,搖勻。準確吸取2.0 mL正戊醇提取液置于15 mL聚四氟乙烯離心管中,加入3 mL鹽酸(1+11)溶液渦旋振搖提取5 min,靜置分層,用潔凈吸管吸取鹽酸提取液(下層),重復(fù)提取并合并提取液,用鹽酸(1+11)溶液定容至10 mL,得到測定用樣品溶液。將該樣品溶液按國標方法第12.2.2條操作進行測定。將國標法測定組胺含量與改進法進行對比。

1.2.2.4 戊醇和鹽酸提取次數(shù)的選擇 在使用1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3中方法處理的基礎(chǔ)上,為簡化國標法的測定,重新探索正戊醇及鹽酸的最適提取次數(shù)(3次提取進行分析),并參照國標方法第12.2.2條操作進行測定。以市售新鮮馬鮫魚及沙丁魚為樣品,分別測定同一樣品在不同提取次數(shù)下的組胺濃度,并將最終得出的最適提取次數(shù)與國標法進行對比,同時進行顯著性分析。

1.2.2.5 酸提取液使用量的選擇 參照國標方法第12.2.2條操作選擇合適的鹽酸提取液使用量,分別測定標準溶液在加入1.0 mL、2.0 mL鹽酸(1+11)溶液時的吸光度,以國標法鹽酸提取液使用量為參照做對比實驗。

1.2.3 胺的測定 吸取1.0 mL試樣提取液(經(jīng)1.2.2改進法處理后鹽酸提取液)于10 mL比色管中,加入3 mL碳酸鈉溶液(50 g/L),3 mL偶氮試劑(甲液:見1.2.2.1;乙液:5 g/L亞硝酸鈉溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。吸取甲液5 mL、乙液40 mL混合)。加水至10 mL,混勻,放置10 min。用分光光度計在480 nm下測量吸光值。

樣品中組胺的含量按下式計算:

式中:X:試樣中組胺的含量(mg/100 g);m1:試樣中組胺的吸光度值對應(yīng)的組胺質(zhì)量(μg);V1:加入三氯乙酸溶液的體積(mL);10:第一個是正戊醇提取液的體積(mL),第二個是鹽酸提取液的體積(mL);m2:取樣量(g);2:第一個是三氯乙酸提取液的體積(mL);第二個是正戊醇提取液的體積(mL);V2:鹽酸提取液的體積(mL);100、1000:換算系數(shù)。

1.2.4 準確度實驗 以新鮮海鰻魚,紅線魚,帶魚為樣品,按1.2.2中改進法處理,在1.2.3測定中,分別加入組胺10、20、40 μg,后定容至10 mL。加標后測定其組胺濃度,同時計算加標回收率。加標回收率計算公式為:

回收率(%)=(測得值-本底值)×100/加標值。

1.2.5 密度實驗 取新鮮紅線魚,帶魚,黃花魚,按1.2.2中改進法處理并進行測定,每個樣品平行測定10次,同時計算相對標準偏差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)采用平均值表示,組間進行顯著性分析(p=0.05),數(shù)據(jù)處理及圖表繪制均使用Microsoft Excel 2007軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法改進實驗結(jié)果分析

2.1.1 甲液的改進效果 由圖1可知,組胺在0～20 μg范圍內(nèi)吸光值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,y=0.0279x-0.0012,相關(guān)系數(shù)r=0.9991。改進法中對硝基苯胺可完全溶解,因此使用改進法進行實驗,得到的標準曲線顯色正常,并且吸光度可呈良好線性關(guān)系。

圖1 改進甲液所得組胺濃度標準曲線Fig.1 Standard curve of histamine concentration for preparing A solution by modified method

2.1.2 氯乙酸浸提條件的改進效果 由表1可知,改進后浸提效果與國標法大致相同,但現(xiàn)行的國標法在前處理時,需用三氯乙酸溶液浸泡2～3 h,因此對比可見,改進法浸提所需時間短,效率更高。

表1 不同條件下三氯乙酸浸提組胺含量對比(mg/100 g)Table 1 Comparison of histamine concentration of trichloroacetic acid solution under different conditions(mg/100 g)

2.1.3 戊醇和鹽酸提取方式的改進效果 由表2可以看出,使用離心管渦旋振蕩法提取樣品,所得測定結(jié)果RSD為1.19%～5.50%;而使用國標法時,RSD為11.39%～16.30%,且對于同一樣品,離心管渦旋振蕩法所測結(jié)果數(shù)值高于國標法。以此可知,離心管渦旋振蕩法提取效果及精密度均優(yōu)于國標法。這是由于使用分液漏斗進行提取,過程操作復(fù)雜,步驟繁瑣,且在分液漏斗多次轉(zhuǎn)移過程中會有部分濾液與器皿粘連,導(dǎo)致樣品損失,誤差偏大,而改進法簡化了轉(zhuǎn)移及提取步驟,有效減少了提取過程中的樣品損失。

表2 不同提取方式含量測定結(jié)果對比Table 2 Comparison of the determination results of different extraction methods

2.1.4 戊醇和鹽酸提取次數(shù)的選擇 由表3可知,渦旋振蕩法提取,正戊醇提取3次,鹽酸提取2次時,提取效果與國標法大致相同;由圖2對比,不同鹽酸提取次數(shù)對組胺測定結(jié)果無顯著性差異(t=0.44,p>0.05)。因此,使用改進法進行提取后,只需正戊醇提取3次,鹽酸提取2次,既可完成濾液的萃取。

表3 不同提取次數(shù)組胺含量結(jié)果對比(mg/100 g)Table 3 Comparison of histamine concentration of different extraction times(mg/100 g)

圖2 不同鹽酸提取次數(shù)結(jié)果對比圖Fig.2 Comparison of the precision of different hydrochloric acid extraction times

2.1.5 鹽酸提取液使用量的選擇 由表4可以看出,加入2.0 mL鹽酸溶液的標液吸光值很小且不穩(wěn)定,而加入1.0 mL鹽酸溶液時,所測吸光值正常且有較好重復(fù)性。因此,改進法中鹽酸提取液使用量應(yīng)為1.0 mL。這是由于在國標法中,樣品溶液酸度過高,會造成溶液渾濁,從而影響顯色,使測定結(jié)果偏低。竇紅順[11]、王新惠等[12]的研究也證明了這一點。而改進法通過減少鹽酸提取液使用量,從而保證了樣品管與標準管酸度的一致。

表4 不同鹽酸溶液加入量吸光值對比Table 4 Comparison of absorbance value of different hydrochloric acid addition

2.2 準確度實驗

由表5可見,1.2.2中改進法測定回收率分別為92.90%～94.70%、91.50%～94.10%、100.20%～102.20%,由此可知,該改進法具有較高準確度。

表5 樣品加標回收率試驗Table 5 Test of recovery rate of sample adding

2.3 精密度實驗

由表6可見,改進法1.2.2的測定RSD在1.84%～2.32%,精密度較高。

表6 方法精密度試驗Table 6 Precision test of the method

3 結(jié)論

對國標法(GB 5009.208-2016)第二法組胺的測定進行了改進。將對硝基苯胺溶液的配制溶劑改為濃鹽酸;選擇水浴60 ℃保溫0.5 h的方式代替室溫浸泡2～3 h;并改進了萃取步驟,提取過程采用離心管旋渦振蕩提取代替分液漏斗振搖提取,提高了提取效率并獲得了更優(yōu)的提取效果;改鹽酸提取3次為提取2次,與國標法相比無顯著性差異(t=0.44,p>0.05),提取效果不變而效率提高;改取鹽酸提取液為1.0 mL,保證了樣品與標準系列取樣量的一致性。該改進法操作簡單,快速,具有較高的精密度和回收率,可以更好地用于魚類中組胺的測定。