枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肽培養(yǎng)基優(yōu)化及脂肽的初步鑒定

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(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

抗菌脂肽是由革蘭氏陽性芽孢桿菌通過非核糖體合成途徑產(chǎn)生的具有抗菌作用的脂肽類化合物,也叫脂肽類抗生素[1-2],主要分為表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengcin)三大類[3]。其分子由一個(gè)碳脂肪酸鏈和一個(gè)含有7～10個(gè)氨基酸的肽鏈兩部分組成,因此兼有親水和親油特性。氨基酸與烴鏈上的羥基或氨基以內(nèi)酯或酰胺鍵結(jié)合形成環(huán)型脂肽[4]。抗菌脂肽具有抗菌和生物表面活性劑特性,在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化妝品、食品、石油開采和環(huán)境治理等領(lǐng)域有重要的開發(fā)和應(yīng)用前景[5],已引起廣泛的關(guān)注。

不同枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生脂肽類抗菌物的情況有很大的差異,即使同一菌株,改變外界(培養(yǎng))條件也可以產(chǎn)生不同的環(huán)脂肽變異體[6-9]。因此研究特定菌株產(chǎn)生的脂肽抗菌物的性質(zhì)為脂肽的分離純化和利用奠定了基礎(chǔ)。

目前脂肽的發(fā)酵方式研究以液態(tài)發(fā)酵為主,但液態(tài)發(fā)酵也存在諸多問題,例如對(duì)設(shè)備的高要求、高成本等,固態(tài)發(fā)酵具有發(fā)酵設(shè)備簡(jiǎn)單,單位基質(zhì)濃度高,也可以避免液態(tài)發(fā)酵過程中脂肽的表面活性特點(diǎn)而出現(xiàn)起泡、跑料嚴(yán)重等問題[10]。本研究中利用的發(fā)酵氮源豆粕為大豆加工副產(chǎn)品[11],用低廉的原料來提高脂肽的生產(chǎn)效益,稻草和啤酒糟[12]等已被用作生產(chǎn)抗菌脂肽的發(fā)酵基質(zhì),Kim等[13]研究表明Bacillus polyfermenticus KJS-2(BP-KJS-2)菌株用大豆作為固態(tài)基質(zhì)也可以固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)surfactin,也說明了以低廉原料產(chǎn)抗菌脂肽的固態(tài)發(fā)酵方式的巨大潛力,但是,目前對(duì)固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵過程中的顯著工藝參數(shù)和因素水平缺乏系統(tǒng)性的描述,影響抗菌脂肽的生產(chǎn)效率。

本研究對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌脂肽組分進(jìn)行分析基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman對(duì)固態(tài)發(fā)酵過程的顯著因子進(jìn)行篩選,采用Box-Behenken得到顯著因子的最佳水平和交互作用,確定了較優(yōu)的培養(yǎng)基組分,為抗菌脂肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要設(shè)備

豆粕 購于青島渤海實(shí)業(yè)有限公司;枯草芽孢桿菌N-2(BacillussubtilisN-2) 保存于中國海洋大學(xué)應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室；指示菌:蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus) 保存于中國海洋大學(xué)應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室;Surfactin(表面活性素)、Iturin(伊枯草菌素)標(biāo)準(zhǔn)品 購于美國Sigma公司;種子液培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH7.0;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:豆粕50 g,K2HPO41.28 g、葡萄糖0.85 g,KCl 0.17 g,MgSO40.21 g,谷氨酸鈉0.85 g,FeSO40.13 g,MnSO40.26 g,CuSO40.13 g,蒸餾水35 mL,pH7.0 以上試劑均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HZQ-C型空氣浴振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠;LDZX-40BI型自動(dòng)電壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DPR-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FD-1A冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng) 美國Agilent科技公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及脂肽的制備 將保存在斜面上的枯草芽孢桿菌N-2接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min培養(yǎng)18 h,按照接種量10%接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)48 h,將發(fā)酵的底物與蒸餾水1∶10 (w/v)通過在室溫下攪拌1 h混合,以360×g離心10 min以除去不溶物質(zhì)。向上清液中加入6 mol/L HCl至最終pH為2.0,并在4 ℃保存12 h以沉淀粗脂肽,通過在4 ℃以360×g離心20 min取沉淀并按照1∶5 (w/v)加入甲醇萃取5 h,使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器干燥提取物。將殘余物溶于蒸餾水中,低溫冷凍干燥凍干成粉末狀,將凍干得到的脂肽抑菌物用無菌水復(fù)溶,并用0.22 μm微孔濾膜過濾制得脂肽抑菌物待測(cè)液。

1.2.2 脂肽組分鑒定 對(duì)脂肽抑菌待測(cè)液采用質(zhì)譜法(HPLC-MS)檢測(cè)產(chǎn)物中抗菌脂肽的含量。HPLC條件:色譜柱為Zorbax SB-Aq C18分析柱(4.6×150 mm,5 μm,美國Agilent科技公司);流動(dòng)相:乙腈(A)、水(含0.1%甲酸)(B);洗脫速率:0.4 mL/min;柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;洗脫過程:0～9 min,45% A～55% A;9～20 min,55% A。質(zhì)譜條件:在ESI正離子模式下,采用選擇性離子掃描SIR模式,噴霧電壓4.5 kV;鞘氣壓力40 arb;輔助氣壓力15 au;毛細(xì)管溫度320 ℃,碰撞壓0.2 Pa。

1.2.3 甲醇對(duì)脂肽聚集體的影響 在1%抗菌脂肽待測(cè)液中加入甲醇至終濃度為50%,然后用截留分子量為10 kDa的超濾管超濾,同時(shí)以不加甲醇的0.5%脂肽溶液在相同條件下進(jìn)行超濾作為對(duì)照,以牛津杯法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證濾過液(B、D組)和截留液(A、C組)的拮抗活性。

1.2.4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化 以脂肽抑菌率作為響應(yīng)指標(biāo),采用Design Expert 8.0.6軟件,進(jìn)行2步法優(yōu)化。

1.2.4.1 培養(yǎng)基關(guān)鍵因子的篩選 選取發(fā)酵培養(yǎng)基的8個(gè)因子進(jìn)行篩選,本試驗(yàn)所選取的8個(gè)考察因素及其代號(hào)、編碼水平見表1,其響應(yīng)值為抗菌脂肽抑菌率。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 1 Factors level and codes table of PB design

1.2.4.2 響應(yīng)曲面法(RSM)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett-Burman的實(shí)驗(yàn)因素篩選結(jié)果,考慮因素的顯著效應(yīng)大小及在實(shí)驗(yàn)過程中的實(shí)際情況,選擇下一步試驗(yàn)的中心點(diǎn)和高低水平,仍以抗菌脂肽抑菌率作為響應(yīng)值,采用Box-Behnken(BBD)對(duì)這些因子進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化(見表2),其它培養(yǎng)基條件控制為豆粕50 g,葡萄糖0.85 g,KCl 0.17 g,谷氨酸鈉0.85 g,MnSO40.26 g,CuSO40.13 g得出能使抑菌率達(dá)到最大值的培養(yǎng)基配方。并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,分析響應(yīng)面結(jié)果的可靠性。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 2 Factors levels and codes table of Box-Behnken design

1.2.5 抑菌活性的測(cè)定

1.2.5.1 抑菌圈實(shí)驗(yàn) 采用牛津杯法。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基液體培養(yǎng)12 h的蠟狀芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基稀釋至107cfu/mL,吸取0.1 mL涂牛肉膏蛋白胨平板,在其上放置高溫滅菌后的牛津杯,再加入200 μL脂肽抑菌物于牛津杯,并設(shè)置無菌水對(duì)照組,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,記錄抑菌圈直徑大小,平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5.2 抑菌率的測(cè)定 挑取保存在斜面的蠟狀芽孢桿菌到種子液,37 ℃培養(yǎng)12 h,將種子液分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基稀釋至107cfu/mL,取菌液200 μL,加入到無菌的96孔板上,另外加入10 μL抗菌脂肽待測(cè)物,OD620下測(cè)定吸光度值(初始菌體密度),后放入37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h,后在OD620下測(cè)定吸收值(培養(yǎng)后的菌體密度);同時(shí)設(shè)置空白組(200 μL指示菌液+10 μL甲醇),其計(jì)算公式為[14]:

抑菌率I(%)=(1-AE/AC)×100

其中：I：抗菌脂肽抑菌率(%)；AE：樣品組三次平行吸光值差的平均值；AC：空白組三次平行吸光值差的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)曲面試驗(yàn)均利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽組分鑒定

該抗菌脂肽的陽離子流圖如圖1所示。由圖1可知,在此固態(tài)發(fā)酵工藝條件下所產(chǎn)的抗菌脂肽產(chǎn)物主要包含6種物質(zhì),其[M+H]+離子峰值分別m/z 1043.6、1057.5、1070.2、1084.0,其中[M+2H]2+離子峰值為m/z 717.4、734.7。對(duì)比相關(guān)抗菌脂肽的報(bào)道[15-16]及預(yù)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)品離子峰中Iturin的洗脫時(shí)間為3～6.5 min,Fongcin洗脫時(shí)間為7～10 min,得出此發(fā)酵產(chǎn)物中的抗菌脂肽主要為Iturin(伊枯草菌素)(m/z 1043.6、1057.5、1070.2以及1084.0);另外根據(jù)已有的報(bào)道[17],可確定還有少量的Fengcin(豐原素)(m/z 717.4、734.7)。

圖1 產(chǎn)脂肽樣品陽離子流圖Fig.1 Positive ion current chromatogram of HPLC-MS for antimicrobial lipopeptide extract

2.2 甲醇對(duì)脂肽聚集體的影響

脂肽鏈通常由疏水的脂肪酸鏈和親水的肽環(huán)組成,具有兩親特性,具有臨界膠束濃度(CMC),當(dāng)其在CMC以上時(shí)其單體聚集成分子質(zhì)量比單體大2～3個(gè)數(shù)量級(jí)的膠束[18-22]。通過圖2A～圖2E圖可以得出結(jié)論,不加甲醇組中濾過液(B)未產(chǎn)生抑菌圈,說明脂肽并不能通過截留量為10 kDa的超濾管,其聚集體分子量在10 kDa以上,但是在向脂肽溶液中加入甲醇后,濾過液(D)有活性,說明經(jīng)過甲醇處理后脂肽能夠通過10 kDa的超濾離心管,結(jié)果證明脂肽能夠在溶液中形成聚集體膠束,而甲醇可以對(duì)聚集體進(jìn)行打散,使膠束恢復(fù)成單體。

圖2 甲醇處理前后截留液和濾過液抑菌活性對(duì)比Fig.2 Comparison of antibacterial activity of retentate and filtrate before and after methanol treatment注:A、B組為不加甲醇組,A為截留液,B為濾過液;C、D組為加入甲醇組,C為截留液,D為濾過液;E組為50%甲醇;F組為無菌水對(duì)照組。

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基關(guān)鍵因子的篩選 采用二水平PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基組份進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)選擇N=12的8因素(11個(gè)虛擬項(xiàng)因素)2水平的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果見表3。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 3 PB design and the antimicrobial rate

由表4可以得出結(jié)論,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,各個(gè)模型的顯著水平是由p>|t|決定的,實(shí)驗(yàn)選取的8個(gè)因素有4個(gè)到達(dá)顯著水平(p<0.05),因此選擇MgSO4、FeSO4、K2HPO4、葡萄糖作為影響發(fā)酵過程產(chǎn)脂肽的關(guān)鍵因子。但從本實(shí)驗(yàn)的水平范圍內(nèi)看,MgSO4、K2HPO4、葡萄糖對(duì)脂肽的產(chǎn)生成正效應(yīng),FeSO4對(duì)脂肽的產(chǎn)生呈負(fù)效應(yīng),后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)考慮降低其水平點(diǎn)。有研究顯示[23-24],Mg2+、K+、Mn2+和Fe2+等離子對(duì)抗菌脂肽的產(chǎn)量有影響,目前已觀察到在B.subtilis中存在鐵離子和錳離子的主動(dòng)運(yùn)輸系統(tǒng),二者在生物合成過程中參與了酶的合成。Wei等[25]研究了通過添加鐵鹽和錳鹽提高B.subtilisATCC 21332產(chǎn)抗菌脂肽的量,硫酸亞鐵(1.7 mmol/L)和硫酸錳的添加(0.01 mmol/L)使抗菌脂肽產(chǎn)量由0.33 g/L提高到2.6 g/L。此外,Kinsinger等[26]研究表明B.subtilis內(nèi)用于激活抗菌脂肽合成的PCP區(qū)域的Sfp蛋白活性位點(diǎn)需要Mg2+作為輔助因子,因此Mg2+在抗菌脂肽合成中至關(guān)重要,另有研究表明K+可促進(jìn)抗菌脂肽的分泌[27]。發(fā)酵過程中葡萄糖添加量過大會(huì)使發(fā)酵物過于粘稠,影響發(fā)酵物中抗菌脂肽的提取,因此后續(xù)優(yōu)化中葡萄糖添加量不作為重要因子考慮。

表4 抗菌脂肽回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression coefficients and their significance for antimicrobial lipopepitide

2.3.2 響應(yīng)曲面法(RSM)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.3.2.1 響應(yīng)面預(yù)測(cè)模型的建立及回歸分析檢驗(yàn) 在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Box-Behnken研究因子之間、因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系,本研究對(duì)顯著的3個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)響應(yīng)值與預(yù)測(cè)值見表5。利用Design Expert軟件對(duì)響應(yīng)值與水平進(jìn)行多元擬合,回歸方程:

表5 Box-Behnken方案及抑菌率的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值Table 5 BBD along with the actual and predicted values of antimicrobial rate

Y=60.73+16.42A+9.9B+6.36C+5.53AB+9.24AC+3.13BC-6.76A2-12.73B2-18.77C2

式中:Y為抑菌率的預(yù)測(cè)值,A、B、C分別代表MgSO4、K2HPO4、FeSO4的編碼值。

根據(jù)變異系數(shù)對(duì)二次方程的顯著性進(jìn)行分析,結(jié)果見表6。

表6 抑菌率回歸方程方差分析及其顯著性檢驗(yàn)Table 6 ANOVA for the regression equation and their significance of antimicrobial rate

2.3.2.2 抑菌率響應(yīng)面結(jié)果分析與驗(yàn)證 通過脂肽抑菌率回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及等高線圖可見圖3～圖5,對(duì)影響脂肽抑菌率的顯著因子之間兩兩交互效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)并確定每個(gè)因子的最佳水平范圍。

圖3 MgSO4和K2HPO4交互影響抗菌脂肽抑菌率的曲面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and its contour plot of the antimicrobial rate antibiotics versus MgSO4 and K2HPO4 concentrations

圖5 MgSO4和FeSO4交互影響抗菌脂肽抑菌率的曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and its contour plot of the antimicrobial rate antibiotics versus MgSO4 and FeSO4 concentrations

圖3顯示了 FeSO4處于最佳值0.13%時(shí),MgSO4和K2HPO4對(duì)脂肽抑菌率的交互影響效應(yīng)。由圖3可以直觀地看出此兩因素的交互作用對(duì)抑菌率影響顯著(p<0.01),坡面及等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,坡面陡峭,橢圓形表示兩因素交互作用顯著;而坡面平緩,圓形則與之相反;圖4顯示了K2HPO4處于最佳值1.7%時(shí),MgSO4和FeSO4對(duì)抑菌率的交互影響顯著(p<0.05)。當(dāng)MgSO4的濃度為0.39%時(shí),在0.05%～0.13%范圍內(nèi),抑菌率隨著FeSO4濃度增加而增加,但超過此范圍,抑菌率呈現(xiàn)負(fù)增加;圖5顯示了MgSO4處于最佳值0.39%時(shí),響應(yīng)面三維圖有凸起的高點(diǎn),FeSO4和K2HPO4對(duì)脂肽的交互影響較為顯著。

圖4 MgSO4和FeSO4交互影響抗菌脂肽抑菌率的曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and its contour plot of the antimicrobial rate antibiotics versus MgSO4 and FeSO4 concentrations

各因素的響應(yīng)面及等高線(圖3～圖5)結(jié)合二次回歸方程顯示,曲面的極值點(diǎn)即抗菌脂肽抑菌率的最大預(yù)測(cè)值為77.75%,其對(duì)應(yīng)的條件則為:MgSO40.39%、K2HPO41.70%、FeSO40.13%。

在得到最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上,選取3組相近的發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表7,從表中的數(shù)據(jù)結(jié)果可以得出,在最優(yōu)條件下,抗菌脂肽的抑菌率能夠達(dá)到的實(shí)際值為75.62%±0.36%,較優(yōu)化前條件下抑菌率的53.24%±0.23%,提升了近二分之一。

表7 抗菌脂肽抑菌率模型驗(yàn)證試驗(yàn)Table 7 Antimicrobial rates of lipopeptidemodel validation experiments

3 結(jié)論

本研究采用成本低廉的固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)生脂肽類抗生素,其組分包括伊枯草菌素(m/z 1043.60、1057.50;1070.20、1084.00),豐原素(m/z 717.40、734.70),并確定了甲醇等有機(jī)溶劑能夠?qū)χ哪z束聚集體產(chǎn)生影響并將其打散形成單體,為后續(xù)脂肽的分離純化等應(yīng)用提供參考;通過Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)篩選出影響發(fā)酵過程的三個(gè)顯著因子MgSO4、K2HPO4、FeSO4,并在MgSO40.39%、K2HPO41.70%、FeSO40.13%的條件下,抗菌脂肽的抑菌率能夠達(dá)到75.62%±0.36%,較優(yōu)化前條件下抑菌率的53.24%±0.23%,提升了近二分之一,也說明了響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件方便快捷,是行之有效的一種方法,試驗(yàn)結(jié)果也為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論參數(shù)。