酸棗多糖鐵藥理活性初步研究

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(陜西中醫(yī)藥大學，陜西省中藥資源產業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西咸陽 712083)

鐵是人體內最重要的元素之一,對人體正常功能尤其是機體代謝和免疫功能[1]的維持具有重要的作用。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計,世界上46%處于5～14歲年齡段的兒童和48%的孕婦患有貧血,且大多數(shù)屬于缺鐵性貧血(IDA)[2]。IDA主要是由鐵攝入不足、機體對鐵吸收不良或鐵的過度流失造成的[3]。酸棗(ZiziphusjujubeMiller.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou)是鼠李科棗屬植物的一種,廣泛分布于我國北方各地,其種仁具有安神補腦的功效,是我國傳統(tǒng)名貴中藥的一種[4]。因此目前對于酸棗資源的也開發(fā)主要集中于其種仁,而研究表明酸棗果肉中亦含有多種活性成分、具有多種功效,其中酸棗多糖具有諸如保肝、抗實驗性結腸炎、改善肥胖等作用,因此受到研究者的廣泛關注[5-8]。

目前臨床用以改善IDA癥狀的藥物主要有亞鐵鹽如硫酸亞鐵、富馬酸亞鐵和葡萄糖酸亞鐵等[9]。但是長期服用此類亞鐵制劑會導致惡心、嘔吐、腹痛和便秘等胃腸道副作用[10]。在過去的30多年里,糖鐵復合物—右旋糖酐鐵、蔗糖鐵復合物等注射劑被用于改善IDA癥狀[11-13]。蔗糖鐵復合物已在歐洲使用了近50年[14-17],相比于硫酸亞鐵鹽等補鐵制劑相對安全、副作用小,但重復注射右旋糖酐鐵可引起肉瘤、無菌膿腫、組織壞死甚至死亡等嚴重副作用[18]。近年來相關研究人員已對黃芪、枸杞、當歸等植物多糖鐵復合物進行了系列表征及藥理活性研究,研究表明植物多糖可與鐵形成穩(wěn)定的配合物且在生理條件下鐵的濃度相對較高,毒副作用較小,是治療IDA的理想補鐵制劑[19]。

而酸棗多糖鐵復合物的制備及其藥理活性研究較少,本課題組前期通過微波輔助提取了酸棗多糖并對其理化性質做了初步研究[20]。本文將對其藥理活性進行初步的探索,為治療缺鐵性貧血提供一種新的補鐵制劑,同時為酸棗資源的開發(fā)利用提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗(10月份成熟后采摘且干燥后使用) 陜西延安;SPF級雄性SD大鼠(重量180～220 g,8周齡，60只) 購自西安交通大學動物實驗中心,動物許可證號SCXK(陜)2017-003；DPPH、ABTS 純度>99%,北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒 純度>98%,北京索萊寶科技有限公司;鐵標準溶液 純度>99.6%,批號2017082721,國家標準物質中心;力蜚能膠囊(150 mg/粒) 批號171670P1,珠海許瓦茲制藥有限公司;其余試劑 均為國產分析純。

WFX-210火焰原子吸收分光光度計 瑞利,北京;UV-2600紫外-可見光分光光度計 島津,日本;傅立葉變換紅外(FTIR)光譜儀 賽爾默,美國;S-4800掃描電鏡 日立,日本;BC-5300獸用血細胞分析儀 邁瑞,深圳。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗多糖鐵的制備 酸棗多糖及多糖鐵的制備參照文獻[20-22]進行,將去核后的干燥酸棗果肉于9倍去離子水中100 ℃提取三次后,合并提取液濃縮至一定體積并采用Sevage法去除蛋白,之后用無水乙醇調節(jié)乙醇濃度為80%進行多糖沉淀,沉淀后產物溶于少量去離子水進行透析(14000 Da)以去除小分子單糖,透析產物冷凍干燥后為酸棗多糖(ZJSP)。將1 mL 2 mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入到酸棗多糖與枸櫞酸鈉的水溶液中,全稱刺激攪拌并用2 mol/L HCl或2 mol/L NaOH保持反應液pH為9,1 h后終止反應,將反應產物置于去離子水中透析48 h(14000 Da)后經無水乙醇沉淀,冷凍干燥后所得產物為酸棗多糖鐵ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物。

1.2.2 鐵含量的測定 鐵含量的測定采用火焰原子吸收分光光度法(FAAS),將所測物經濃鹽酸及濃硝酸消解后溶于1% HCl中進行含量測定,根據(jù)GB/T 11911-1989的方法:波長213.9 nm,燈電流2.5 mA,狹縫1.2 nm,空氣流量5 L·min-1,乙炔流量為1 L·min-1,用Fe標準溶液得校準曲線(y=0.0741x+0.0183;R2=0.9994,0.05～0.85 μg·mL-1)。

1.3 酸棗多糖鐵結構表征

以葡萄糖為標準品采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[23](y=1.7898x+0.0226,R2=0.9968,0.05～0.35 mg·mL-1);以牛血清為標準品采用Bradford法測定蛋白質含量[24](y=4.1530x+0.6045,R2=0.9996,0.65～1.32 mg·mL-1);以沒食子酸為標準采用福林-酚試劑測定總酚含量[25](y=31.2732x+0.0527,R2=0.9996,0～0.06 mg·mL-1);將樣品溶解在5%鹽酸溶液中進行全波長掃描(200～400 nm);將2 mg樣品與200 mg KBr壓片后傅進行了紅外光譜掃描(4000～500 cm-1),其微觀形態(tài)采用SEM進行掃描分析。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基清除活性 根據(jù)文獻[26]報道方法,將1.2.1中制備所得ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物溶于去離子水后過0.45 μm濾膜,將1.5 mL溶液與1.5 mL DPPH(25 mg/L)乙醇溶液經渦旋混合后置于室溫25 ℃孵育30 min(空白為去離子水,陽性為VC),于517 nm處測量溶液吸光度。

DPPH自由基清除率按公式(1)進行計算:

式(1)

式中:A0、A1與A2分別為空白溶液、樣品溶液初始及終止吸光度。

1.4.2 ABTS自由基清除活性 根據(jù)文獻[27-28],將1.2.1中制備所得ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物去離子水溶液與4.0 mL ABTS(7 mmol/L)經渦旋混合后置于室溫25 ℃孵育30 min(空白為去離子水,陽性為VC)。ABTS 自由基清除率根據(jù)公式(2)進行計算:

式(2)

式中:A0、A1與A2分別為空白溶液、樣品溶液初始及終止吸光度。

1.4.3 羥基自由基(·OH)清除活性 根據(jù)文獻[29-30]報道方法,將1.0 mL ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物去離子水溶液分別與1.0 mL FeSO4(9 mmol/L)渦旋混合后先后加入1.0 mL水楊酸乙醇溶液(9 mmol/L)0.05 mL H2O2(9 mmol/L)溶液渦旋混合,置于37 ℃保持30 min(空白為去離子水,陽性為VC),·OH清除率按公式(3)進行計算:

式(3)

式中:A0、A1與A2分別為空白溶液、樣品溶液初始及終止吸光度。

1.5 ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物體外釋鐵性能

ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物體外釋鐵性能按照文獻報道方法進行并做略微改動[31-33],具體操作細節(jié)為:先將1 g ZJSP-Fe(III)復合物粉末置于1000 mL人工胃液(2.0 g NaCl,3.2 g胃蛋白酶,80 mL 1 mol/L HCl去離子水稀釋至1000 mL,pH=2.0)中2 h,然后改變其pH使其人工腸液8左右(5.0 mL 膽汁鹽溶液25.0 g/L,胰腺提取物4.0 g/L,0.1 mol/L NaHCO3調節(jié)pH為8),放置3 h,溶液溫度始終控制在37 ℃,第1 h每隔20 min取一次樣,之后每30 min取一次樣,樣品過0.45 μm濾膜后經原子吸收測定其中鐵含量。鐵釋放率按照下式進行計算

式(4)

式中:F1為溶液中鐵總量,F0為多糖鐵中鐵含量。

1.6 缺鐵性貧血大鼠模型試驗

動物實驗依據(jù)陜西中醫(yī)藥大學實驗動物福利實施細則,自由飲食和攝水,每日明暗交替12 h,溫度保持(25±1) ℃,適應環(huán)境7 d后進行造模?？瞻捉M(10只)食用正常維持飼料(Fe 173.12 mg/kg),對其余50只大鼠采用AOAC低鐵飼料(Fe 10.37 mg/kg)飼喂,輔以眼靜脈放血每周三次[22],造模時間一個月,造模后采用血細胞自動分析儀測定紅細胞數(shù)量(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)以及紅細胞體積分布寬度(RDW),另外采用Elisa法測量血清中促紅細胞生成素(EPO)以及Hepcidin含量。將造模成功后的SD大鼠(Hb<110 g/L)隨機分為模型組、陽性藥力蜚能組(12 mg Fe/kg體重)、ZJSP-Fe(Ⅲ)高中低劑量組(24、12、6 mg Fe/kg體重)，每組10只。陽性藥采取臨床上治療IDA廣為使用的右旋糖酐鐵制劑,各組灌胃給藥四周后取眼靜脈血測血常規(guī)及EPO、Hepcidin血鐵含量,比較各組之間差異。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0軟件,作圖選Graph pad prism 5.0,p<0.05 視為有顯著性差異,p<0.01視為有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 ZJSP-Fe(Ⅲ)表征

2.1.1 組分分析 以葡萄糖為標準品用苯酚-硫酸法[23]測得其多糖含量為67.31%±2.37%,酸棗多糖鐵中鐵元素含量為21.37%±0.84%,蛋白含量為2.37%±0.53%,Fe含量為21.37%±0.43%。

2.1.2 UV分析 如圖1所示,在280與305 nm處有微弱峰是其中的蛋白的吸收峰[34],與2.37%的蛋白含量相互佐證酸棗多糖為多糖蛋白復合物,因為酸棗多糖中的蛋白已由多次Savage法除去,這與青錢柳多糖含有17種氨基酸[35]可以相互印證,且在235 nm處的吸收峰推測是由于酸棗多糖形成的鏈狀結構纏繞呈類卟啉結構與鐵元素結合造成其共軛結構增大,從而導致其特征峰的紅移。

圖1 紫外全波長掃描圖Fig.1 UV full wavelength scanning spectrum

2.1.3 紅外圖譜分析 紅外分光光度法(FT-IR)因其可以提供大量的結構信息而被廣泛用于多糖結構的表征[36]。酸棗多糖與ZJSP-Fe(Ⅲ)的紅外圖譜見圖2,與文獻[37-38]報道多糖類物質結構信息類似。3223和3256 cm-1處吸收峰是由于-OH伸縮振動,2885、2882 cm-1處吸收峰可歸為C-H伸縮振動[39],1728 cm-1處弱吸收峰指示酸棗多糖中的醛酸物質[40]。1586和1593 cm-1處高而尖的吸收峰可能是由于C=C 或 C=O基團的存在[41],在1013 cm-1處吸收峰可歸因于C=N鍵伸縮振動,1728 cm-1處吸收峰可能是由于脂基的存在[42],而889 cm-1處吸收峰可歸為酸棗多糖中β-D-葡聚糖的存在[42],在1200～800 cm-1段的精細結構可能是由于其中糖蛋白的存在[43],954、889、644和 663 cm-1處吸收峰推測是由于酸棗多糖絡合鐵后相對酸棗多糖有所改變,指示有FeOOH基團的存在[44-45]。

圖2 紅外圖譜Fig.2 IR spectrum

2.1.4 形態(tài)分析 ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物的形態(tài)如圖3所示,電鏡掃描顯示酸棗多糖鐵呈片狀且有微小粉末吸附在其表面,能譜分析(EDS)圖4顯示ZJSP-Fe(Ⅲ)中含有豐富的鐵元素,重量比和原子數(shù)量比可分別達到 36.27%和12.45%,和原子吸收測得其中高達21.37%的鐵含量相對應。

圖3 酸棗多糖鐵電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM images of ZJSP-Fe(Ⅲ)complex注:a(100000×)；b(400000×)。

圖4 酸棗多糖鐵能譜分析圖及元素分析表Fig.4 Energy spectrum elemental analysis of ZJSP-Fe(Ⅲ)complex

2.2 生物活性

2.2.1 抗氧化活性 如圖5a所示,VC對DPPH自由基的清除活性較顯著,ZJSP和ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物在10～1000 μg/mL范圍內對DPPH具有一定的清除活性,且具有劑量依賴性。VC、ZJSP和ZJSP-Fe(Ⅲ)EC50分別為0.41、4.1和1.47 mg/mL。而在濃度為1000 μg/mL時ZJSP-Fe(Ⅲ)比ZJSP清除率高96.37%。圖5b為ZJSP-Fe(Ⅲ)的ABTS自由基清除活性,VC、ZJSP及ZJSP-Fe(Ⅲ)的EC50分別為0.13、16.37、10.21 mg/mL。在濃度為20 mg/mL時,ZJSP-Fe(Ⅲ)比ZJSP清除活性高21.28%。由圖5c可知ZJSP與ZJSP-Fe(Ⅲ)的·OH清除率要低于VC(EC50為0.021 mg/mL),ZJSP與ZJSP-Fe(Ⅲ)EC50分別為1.73與0.37 mg/mL,在濃度為1000 μg/mL時,ZJSP-Fe(Ⅲ)比ZJSP清除率高31.53%。推測ZJSP-Fe(Ⅲ)的清除活性優(yōu)于ZJSP部分原因是鐵與多糖共軛引起的結構變化以及其分子量的改變導致其抗氧化活性增強[46]。

圖5 酸棗多糖鐵的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of ZJSP-Fe(Ⅲ)注：a.DPPH自由基清除率；b.ABTS 自由基清除率；c.·OH清除率。

2.2.2 體外釋鐵實驗 為研究ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物的鐵釋放活性,分別在人工胃液(pH2.0)2 h和人工腸液pH8.0)3 h進行體外鐵釋放試驗,鐵含量按1.2.2法測定,并計算其釋放率。如圖6所示,ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物具有良好的釋藥活性,在人工胃液中作用23 min后,鐵的釋放率已達50%,1 h后達到82.3%,在人工腸液3 h后釋鐵率可達89.28%。結果表明,ZJSP-Fe(Ⅲ)配合物具有良好的鐵活性。

圖6 酸棗多糖鐵體外釋鐵活性Fig.6 Iron release activity of ZJSP-Fe(Ⅲ)complex

2.3 動物實驗

2.3.1 模型的建立 相比較正常飲食組大鼠,缺鐵飼料飼養(yǎng)模型組大鼠在第二周開始出現(xiàn)皮膚蒼白、反應遲鈍,皮毛粗糙稀疏并隨時間延長更易脫落。由表1可知，造模后得模型組大鼠體重極顯著(p<0.001)低于空白組大鼠,血液學各項指標顯示,模型組大鼠RBC、HGB、HCT、MCH均極顯著或顯著(p<0.01,p<0.05)降低,而MCV(p<0.01)與RDW-CV(p<0.05)顯著增加,各結果采用t檢驗,其中Hb低于100 g/L且p<0.05表明缺鐵性貧血大鼠模型各項指標有統(tǒng)計學差異,指示造模成功,隨著造模時間的延長,IDA大鼠經過自身調節(jié)后,經ELISA檢測,結果顯示模型組大鼠血液中EPO水平比空白組高11.17%,Hepcidin含量下降可達3.6%,Hepcidin受缺鐵、貧血及缺氧等影響而在大鼠體內表達減少,從而促進腸道吸收和促進鐵的釋放,可以滿足機體對鐵元素的需求。

表1 造模后大鼠機體各項指標變化Table 1 Changes of physiologic Indexes in rats after model establishment

2.3.2 體重增量的改變 圖7所示為給藥后各組的體重增量的比較,由圖6可知:模型組的體重增量顯著(p<0.05)低于空白組,顯示缺鐵性貧血會影響大鼠的生長發(fā)育,這與文獻[47]報道的IDA大鼠模型顯示較差的食欲和較慢的生長速度相一致。這可能是由于鐵元素的缺乏會影響酶的活性或細胞的氧的供給,從而降低了機體的能量代謝[48]。不同劑量的ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物給藥組相對于模型組的體重增量有顯著增高(p<0.05),其中低劑量ZJSP-Fe(Ⅲ)相比較模型組p=0.0371,中劑量為0.0087,高劑量為0.0059并且中高劑量組的體重增量和空白相比p值分別為0.3721與0.5127,指示無顯著性差異,結果顯示ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物對于IDA大鼠模型具有良好的改善其缺鐵性貧血狀態(tài)的作用。

圖7 不同組大鼠的體重增量比較Fig.7 Body weight changes of rats in different groups注:#表示模型組與空白組相比有顯著性差異,p<0.05;##表示模型組與空白組相比有極顯著性差異,p<0.01;*表示給藥組與模型組相比有顯著性差異,p<0.05;**表示給藥組與模型組相比有極顯著性差異,p<0.01;圖7～圖9，表2同。

2.3.3 血液指標的改變 促紅細胞生成素(EPO)又稱紅細胞刺激因子、促紅素,是一種人體內源性糖蛋白激素,可刺激紅細胞生成[49],由圖8可知:模型組大鼠血清EPO水平相比較空白組相比p=0.00874,指示其顯著降低,這與模型組大鼠血中紅細胞數(shù)量較少相吻合,而陽性藥力蜚能組與ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物高中低劑量組均能顯著增加大鼠血清中EPO含量,且其水平與空白組相比無顯著性差異。

圖8 酸棗多糖鐵給藥后EPO變化Fig.8 Changes of EPO after ZJSP-Fe(Ⅲ)complex administration

Hepcidin是一種抗菌肽,其在機體鐵代謝調控中具有重要的作用,現(xiàn)已成為血色素沉著癥(Hereditary hemochromatosis,HH)、慢性貧血(ACD)等鐵代謝障礙性疾病研究的關鍵靶分子。由圖9可知，在本實驗中,模型組大鼠血清中Hepcidin水平相比較空白組p=0.00723指示顯著增高,因此導致大鼠血中紅細胞數(shù)量較少,而陽性藥力蜚能組大鼠血清中Hepcidin水平較模型組有大幅降低,且與空白組無顯著性差異,ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物高中低劑量組對模型大鼠血清Hepcidin有降低趨勢,有一定的劑量依賴性,且中高劑量ZJSP-Fe(Ⅲ)復合物給藥組大鼠血清較模型組有顯著(p<0.05)降低。

圖9 酸棗多糖鐵給藥后Hepcidin水平變化Fig.9 Changes of Hepcidin contents after ZJSP-Fe(Ⅲ)complex administration

由圖10可知,模型組大鼠血中鐵元素含量較空白組相比p=0.0021,指示顯著降低,而與陽性藥組及ZJSP-Fe(Ⅲ)中高劑量給藥組相比較模型組有極顯著性差異,且與空白組相比已無顯著性差異。

圖10 酸棗多糖鐵給藥后血中鐵含量變化Fig.10 Changes of blood iron contents after ZJSP-Fe(Ⅲ)complex administration

表2為不同組大鼠眼底靜脈叢取血測得血常規(guī)指標,由表可知,模型組大鼠相比較空白組大鼠其RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC等指標均有降低趨勢,其中RBC、HGB、HCT三個指標降低較明顯(p<0.05),而MCV、RDW-CV、RDW-SD略有升高。在不同劑量ZJSP-Fe(Ⅲ)給藥組大鼠中,RBC、HGB、HCT、MCV均有不同程度改善,但MCH與RDW-SD較模型組無顯著性變化。總體表明不同劑量ZJSP-Fe(Ⅲ)給藥組大鼠能有效改善IDA大鼠體內RBC、HGB、HCT、RBC、HGB、HCT、MCV等指標,且隨著劑量的增加,其改善效果逐漸增強且與陽性藥效果接近。

表2 酸棗多糖鐵給藥后血常規(guī)指標變化Table 2 The changes of blood routine after the administration of ZJSP-Fe(Ⅲ)

3 結論

實驗制備的酸棗多糖鐵復合物在體外具有一定的抗氧化活性與良好的體外釋鐵性能,針對IDA大鼠模型實驗顯示制備的酸棗多糖鐵復合物能夠有效改善大鼠血清中的EPO、Fe、RBC、HGB、HCT、MCV等指標水平,且有效降低了大鼠血清中Hepcidin的水平,因此酸棗多糖鐵復合物有望成為一種安全有效的新型補鐵劑應用于缺鐵性貧血研究,且需要進一步動物實驗來研究其改善大鼠缺鐵性貧血水平的機理。