0.2%二氫卟吩鐵可溶粉劑HPLC測(cè)定方法不確定度評(píng)估

曹 磊

（國(guó)家農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （南京），江蘇 南京 210007）

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。評(píng)定不確定度是分析工作最基本也是最重要的指標(biāo)，是反映檢測(cè)全過(guò)程的重要標(biāo)志。不確定度評(píng)定作為測(cè)試和校準(zhǔn)方法及方法驗(yàn)證的一個(gè)重要技術(shù)，要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立并實(shí)施測(cè)定不確定度的評(píng)價(jià)程序。若檢測(cè)結(jié)果處于標(biāo)準(zhǔn)限量的臨界值時(shí)，必須給出不確定度以滿足對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)判，讓客戶從測(cè)量結(jié)果了解測(cè)定數(shù)據(jù)的離散程度。

二氫卟吩鐵是從蠶沙中提取的具有調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)的家型天然植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，主要作用為調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)，對(duì)抗逆和產(chǎn)量都有較好的增收作用。其作用機(jī)理是通過(guò)抑制葉綠素酶而緩解葉綠素的降解，提高葉綠素含量，并提高光系統(tǒng)Ⅱ （PSⅡ） 的最大光化學(xué)效率 （Fv/Fm），能夠促進(jìn)根細(xì)胞內(nèi)NO的生成和降低吲哚乙酸氧化酶的活性，促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)；明顯提高活性氧清除酶活性，促進(jìn)抗氧化物脯氨酸含量升高。經(jīng)室內(nèi)活性試驗(yàn)和田間藥效試驗(yàn)，結(jié)果表明0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑對(duì)油菜生長(zhǎng)有較好的調(diào)節(jié)活性，能夠增加單株角果數(shù)，每角粒數(shù)，千粒重等[1]。本文研究了液相法測(cè)定二氫卟吩鐵含量過(guò)程中不確定度的評(píng)定與表示方法，具有借鑒及參考意義。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器及試劑 Agilent 1260 高效液相色譜儀；250mm×4.6mm （i.d） 不銹鋼柱，內(nèi)裝Agilent ZORBAX SB-C18，5μm填充物；電子分析天平 （XS105DU 型，METTLER TOLEDO）；超聲清洗儀 （KQ-300E）；甲醇 （含量99.9%，色譜純）；磷酸 （含量 99.5%，分析純）；家蒸二次蒸餾水 （18.2MΩ·cm，Milli-Q）；二氫卟吩鐵標(biāo)樣 （純度93.0%，國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心（沈陽(yáng)） 提供）；0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑（企業(yè)提供）。

1.2 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇+磷酸水溶液（pH2.0）=50 +50 （v/v）；流速：1.0mL/min；柱 溫：25℃；檢 測(cè) 波 長(zhǎng)：392nm；進(jìn) 樣 體積：5μL；

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制 稱取0.05g二氫卟吩鐵標(biāo)樣 （精確至0.000 2g），置于50mL容量瓶中，加甲醇后超聲使溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度后搖勻過(guò)濾即得；

1.3.2 樣品溶液的配制 稱取6g試樣 （精確至0.000 2g），置于 50mL容量瓶中，加甲醇后超聲使溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度后搖勻過(guò)濾即得；

1.3.3 按照連續(xù)5 針標(biāo)樣溶液、連續(xù)5 針樣品溶液的順序進(jìn)樣；

1.3.4 計(jì)算 試樣中二氫卟吩鐵的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω1（%） 按右式計(jì)算：

式中：

A2——試樣溶液中，二氫卟吩鐵峰面積的平均值；

A1——標(biāo)樣溶液中，二氫卟吩鐵峰面積的平均值；

m1——標(biāo)樣的質(zhì)量，單位為克 （g）；

m2——試樣的質(zhì)量，單位為克 （g）；

w——二氫卟吩鐵標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以%表示。

標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的典型色譜圖 （圖1 及圖2）：

圖2 樣品色譜圖

2 檢測(cè)方法不確定度評(píng)定

2.1 不確定度的來(lái)源 以二氫卟吩鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為數(shù)學(xué)模型，可得出不確定度分量來(lái)源包括：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量及配制、樣品稱量及配制、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品測(cè)量的重復(fù)性。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)中提供的信息，二氫卟吩鐵純度為93.0%，不確定度為 ±0.2%，屬于B類評(píng)定。按正態(tài)分布[2]，取置信水準(zhǔn)為95%，K=2，則有：U1=0.2/（2 ×93.0）=1.08 ×10-3；

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度 查稱量所使用的電子天平檢定證書(shū)，其最大允許誤差為±0.1mg，屬于 B類評(píng)定，按正態(tài)分布[1]，取置信水準(zhǔn)p=99%，K=3，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U2=0.1mg/3=0.033 3mg，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重復(fù)稱量2次，稱樣量為0.051 2 g，則其相對(duì)不確定度為；

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制引入的不確定度

2.4.1 50mL容量瓶引起的體積不確定度 容量允許誤差為 ±0.05mL[3]，B類不確定度評(píng)定：；

2.4.2 溶液溫度與校準(zhǔn)時(shí)溫度不同引起的體積不確定度 假設(shè)溶液與校準(zhǔn)溫度的差異為±5℃，容量瓶體積為50mL，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2 ×10-3/℃，玻璃的膨脹系數(shù)為 2.5 ×按矩形分布，取則由校準(zhǔn)和使用溫度不同引起的容量瓶體積不確定度為：

2.5 樣品稱量引入的不確定度 參考2.3 所述，樣品重復(fù)稱量2 次，稱樣量為6.584 5g，則其相對(duì)不確定度為10-6；

2.6 樣品溶液配制引入的不確定度 參考2.4所述，樣品溶液配制引入的相對(duì)不確定度即3.44 ×10-3；

2.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品測(cè)量峰面積的重復(fù)性引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液及樣品溶液均重復(fù)進(jìn)樣5 次，峰面積 （表1）：

表1 峰面積測(cè)量結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度為

樣品峰面積測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度為

3 合成相對(duì)不確定度的評(píng)定

綜合上述各不確定分量，得出合成相對(duì)不確定度

本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑中二氫卟吩鐵含量為0.021%，則

4 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

按95%置信概率，取包含因子K=2，則擴(kuò)展不確定度

故本次采用高效液相色譜法測(cè)定0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑中二氫卟吩鐵含量為 （0.021±0.000 2）%。

5 結(jié)論

5.1 在不確定度的評(píng)估過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量和標(biāo)樣及樣品溶液配置、定容操作引入的不確定度占主導(dǎo)地位；

5.2 本試驗(yàn)最終擴(kuò)展不確定度的評(píng)定結(jié)果在符合上述方法和條件的規(guī)范化測(cè)量情況下可直接引用；

5.3 若按雙平行樣雙針進(jìn)樣，按照本文所述依次計(jì)算各步驟不確定度分量、合成不確定度及擴(kuò)展不確定度即可。