穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合氨芐青霉素對(duì)奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠治療作用的研究

吳 斐 劉新平

細(xì)菌性腦膜炎是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)重度感染性疾病，以急性發(fā)熱、驚厥、顱內(nèi)壓升高等為主要臨床表現(xiàn)，兒童患者居多[1]。細(xì)菌性腦膜炎病死率仍高達(dá)20%，并且約30%存活者留有腦麻痹、癲癇、聽(tīng)力損傷、認(rèn)知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2,3]。奈瑟球菌是細(xì)菌性腦膜炎常見(jiàn)致病菌之一，屬革蘭陰性菌，其被殺滅解體后，細(xì)胞壁中的脂多糖將釋放入血而引發(fā)內(nèi)毒素血癥，破壞腦組織結(jié)構(gòu)，是導(dǎo)致患者死亡的主要因素[4,5]?？股厥桥R床治療細(xì)菌性腦膜炎的首選方案，但抗生素并不能有效控制脂多糖水平的升高。單用抗生素治療奈瑟球菌感染腦膜炎效果并不理想[6]。因此，在合理應(yīng)用抗生素抗感染治療的同時(shí)，尋找新的輔助治療藥物與治療方案，對(duì)改善細(xì)菌性腦膜炎預(yù)后具有重要意義。氨芐青霉素(ampicillin，AMP)是臨床治療革蘭陰性菌感染腦膜炎的一線用藥。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AG)是中藥穿心蓮的主要活性成分，具有良好的抗炎活性和抗菌作用[7～9]。本研究探討了AG聯(lián)合AMP對(duì)奈瑟球菌感染腦膜炎的治療作用及其機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果匯報(bào)如下。

材料與方法

1.材料：(1)藥物與試劑：穿心蓮內(nèi)酯膠囊購(gòu)自麗珠集團(tuán)利民制藥廠(批號(hào)：190527)；注射用氨芐西林鈉購(gòu)自齊魯制藥有限公司(批號(hào)：6130104BF)；脂多糖(貨號(hào)：H255，批號(hào)：20190612)、TNF-α(貨號(hào)：H052，批號(hào)：20190531)、IL-1β(貨號(hào)：H002，批號(hào)：20190507)、IL-6(貨號(hào)：H007，批號(hào)：20190416)試劑盒(ELISA法)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；p65(貨號(hào)：K200045M)、IκBα(貨號(hào)：K000498P)、β-actin(貨號(hào)：K200058M)一抗和IgG二抗(貨號(hào)：SW1040)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD系雄性大鼠120只，2周齡，體質(zhì)量80±5g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004；實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3天(溫度25±1℃、相對(duì)濕度60%±5%、光照黑暗各12h交替)。(3)奈瑟球菌株由筆者醫(yī)院微生物室提供，于肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后(恒溫37℃)，劃線接種于固體培養(yǎng)基，取單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體，0.9%NaCl注射液稀釋為濃度1×108個(gè)/升的菌懸液，備用。

2.動(dòng)物分組、造模與給藥：將100只大鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、AG組(50mg/kg)、AMP組(200mg/kg)和聯(lián)合組(AG 50mg/kg+AMP 200mg/kg)共5組[藥物劑量：根據(jù)人和大鼠藥物劑量換算公式，大鼠劑量為毫克/千克(mg/kg)=6.3Xmg/kg(X為人臨床劑量)，按照成人體重65kg計(jì)算可得，AG大鼠劑量為29.08～65.42mg/kg，AMP大鼠劑量為193.85～387.69mg/kg；并參照蔡媛媛等[6]報(bào)道的大鼠實(shí)驗(yàn)劑量，確定本實(shí)驗(yàn)AG劑量為50mg/kg、AMP劑量為200mg/kg]，每組各20只。參照酈錚錚等[2]報(bào)道，采用小延髓池注射10μl奈瑟球菌懸液(濃度1×108個(gè)/升)的方法復(fù)制奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠模型。造模后，AG組1次/12小時(shí)灌胃給藥，AMP組1次/12小時(shí)皮下注射給藥，聯(lián)合組1次/12小時(shí)灌胃給予AG、皮下注射給予AMP，正常對(duì)照組和模型組灌胃給予0.9%NaCl注射液，共給藥5次。本研究方案經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批件號(hào)為HDZXLL[K]字2019-016。

3.各組大鼠存活率統(tǒng)計(jì)：分別于造模后第12、24、36、48、60h時(shí)統(tǒng)計(jì)各組大鼠存活率，60h時(shí)正常對(duì)照組存活20只、模型組存活0只、AG組存活12只、AMP組存活10只、聯(lián)合組存活16只。因此，模型組于12h時(shí)行各指標(biāo)檢測(cè)(大鼠尚未死亡)，其余各組于60h時(shí)行各指標(biāo)檢測(cè)[6]。

4.癥狀評(píng)分及腦組織含水量檢測(cè)：分別隨機(jī)取正常對(duì)照組和模型組各10只、AG組6只、AMP組5只、聯(lián)合組8只大鼠，參照劉成業(yè)等[10]報(bào)道的方法行癥狀評(píng)分：活動(dòng)和行走未見(jiàn)異常計(jì)0分，活動(dòng)和行走遲緩計(jì)1分，直立動(dòng)作緩慢計(jì)2分，不能直立計(jì)3分。麻醉后脊椎脫臼處死，取腦組織稱重為濕重(W1)，置105℃烤箱至恒重后稱量為干重(W2)，含水量(%)=[(W1-W2)/W1]×100%。

5.血漿脂多糖和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量檢測(cè)：取各組剩余的大鼠，麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)血漿脂多糖含量。脊椎脫臼處死后，取腦組織，去除小腦、腦干，加入9倍量4℃預(yù)冷裂解液、研磨勻漿，3000r/min離心15min后取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

6.腦組織p65、IκBα蛋白表達(dá)檢測(cè)：取腦組織勻漿液，4℃、12000×g離心20min后取上清液，提取總蛋白，行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1h后，滴加p65、IκBα、β-actin一抗后4℃過(guò)夜，洗膜后滴加二抗、室溫孵育1h，洗膜后滴加ECL化學(xué)發(fā)光溶液顯色，以β-actin為內(nèi)參半定量p65、IκBα相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.各組大鼠存活率比較：正常對(duì)照組大鼠60h內(nèi)全部存活，模型組大鼠24h內(nèi)全部死亡；與模型組比較，AG組、AMP組、聯(lián)合組存活率顯著升高(P<0.01)；與AG組和AMP組比較，聯(lián)合組存活率顯著升高(P<0.01)，詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠存活率比較[n(%)]

2.各組大鼠癥狀評(píng)分及腦組織含水量比較：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠癥狀評(píng)分和腦組織含水量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，AG組、AMP組、聯(lián)合組癥狀評(píng)分和含水量顯著降低(P<0.05)；與AG組和AMP組比較，聯(lián)合組癥狀評(píng)分和含水量顯著降低(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠癥狀評(píng)分及腦組織含水量比較

3.各組大鼠血漿脂多糖和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿脂多糖與腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，AG組、AMP組、聯(lián)合組血漿脂多糖與腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著降低(P<0.01)；與AMP組比較，AG組和聯(lián)合組血漿脂多糖和腦組織TNF-α、IL-6含量顯著降低(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血漿脂多糖和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量

4.各組大鼠腦組織p65、IκBα蛋白表達(dá)比較：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織p65表達(dá)顯著上調(diào)而IκBα顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，AG組、AMP組、聯(lián)合組p65表達(dá)顯著下調(diào)且IκBα顯著上調(diào)(P<0.01)；與AMP組比較，AG組和聯(lián)合組p65表達(dá)顯著下調(diào)且IκBα顯著上調(diào)(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1、表4。

圖1 各組大鼠腦組織p65、IκBα蛋白表達(dá)A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.AG組；D.AMP組；E.聯(lián)合組

表4 各組大鼠腦組織p65、IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量

討 論

細(xì)菌性腦膜炎具有多種致病菌，其中奈瑟球菌是最常見(jiàn)的革蘭陰性病原菌之一，AMP是臨床治療革蘭陰性菌感染腦膜炎的一線用藥，而單用AMP治療效果并不理想。因此，尋找新的輔助治療藥物與AMP聯(lián)合應(yīng)用或許是改善奈瑟球菌感染腦膜炎預(yù)后的有效途徑。AG是中藥穿心蓮的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、提高免疫力等多種生物學(xué)活性[11～13]。

AG聯(lián)合AMP治療奈瑟球菌感染腦膜炎的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)，本研究旨在探討AG與AMP聯(lián)合用藥能否改善奈瑟球菌感染腦膜炎治療效果以及提高存活率，并探索其相關(guān)機(jī)制。

本研究采用小延髓池注射奈瑟球菌懸液的方法制備腦膜炎大鼠模型，結(jié)果顯示未給藥干預(yù)的模型組大鼠于24h內(nèi)全部死亡，該結(jié)果與楊新娟[14]的報(bào)道一致。單用AG或AMP治療、AG聯(lián)合AMP(聯(lián)合組)治療能夠明顯提高奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠存活率，其中聯(lián)合組存活率達(dá)80%，明顯高于AG組的60%和AMP組的50%，并且聯(lián)合組大鼠癥狀評(píng)分、腦組織含水量均明顯低于AG組和AMP組；說(shuō)明AG聯(lián)合AMP對(duì)奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠具有較好的治療作用。

奈瑟球菌為革蘭陰性菌，被抗菌藥物殺滅導(dǎo)致其解體后，細(xì)胞壁中脂多糖將釋放入血。脂多糖做為內(nèi)毒素，由O-特異側(cè)鏈、核心多糖、類脂A 3部分構(gòu)成，其中類脂A能夠與Toll樣受體4結(jié)合，刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系統(tǒng)大量釋放炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等，導(dǎo)致系列炎性反應(yīng)，引發(fā)內(nèi)毒素血癥[15～18]。NF-κB以p50/p65二聚體形式存在，生理狀態(tài)下與特異性酶抑制劑IκBα結(jié)合而無(wú)生理活性；IκBα磷酸化使p50/p65與IκBα解離并位移至細(xì)胞核，p65亞基與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合而誘導(dǎo)單核、巨噬細(xì)胞大量合成炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等，進(jìn)而介導(dǎo)炎性反應(yīng)[19, 20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AG或AMP單藥治療、AG聯(lián)合AMP(聯(lián)合組)能夠明顯降低奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠血漿脂多糖和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量，下調(diào)p65表達(dá)并上調(diào)IκBα表達(dá)，并且聯(lián)合組和AG單藥組對(duì)糖多糖、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及p65、IκBα表達(dá)的調(diào)控作用優(yōu)于AMP單藥組，說(shuō)明AG聯(lián)合AMP對(duì)奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠的治療作用可能與AG抑制內(nèi)毒素血癥和NF-κB炎性通路有關(guān)。

綜上所述，AG聯(lián)合AMP能夠降低奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠病死率，改善神經(jīng)癥狀，抑制腦組織水腫，即AG聯(lián)合AMP對(duì)奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠具有良好的治療作用，其機(jī)制可能與AG抑制內(nèi)毒素血癥和NF-κB炎性通路，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，臨床上應(yīng)用抗生素治療奈瑟球菌感染腦膜炎的同時(shí)，可以給予抗炎、抑制內(nèi)毒素血癥和緩解腦水腫的藥物進(jìn)行輔助治療，或許能夠提高治療效果，改善患者預(yù)后。