優(yōu)秀長跑運動員NADPH氧化酶p22phox亞基基因多態(tài)性分子標(biāo)記的探討*

周文婷，胡 揚

(1. 遵義師范學(xué)院體育學(xué)院，貴州 遵義 563006；2. 哈爾濱體育學(xué)院學(xué)術(shù)理論研究部，黑龍江 哈爾濱 150001； 3. 北京體育大學(xué)科學(xué)研究中心，北京 100084)

生物體內(nèi)的能量代謝將氧氣作為生物氧化中的電子受體，從而產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)較活潑的活性氧ROS，一方面發(fā)揮生物學(xué)功能，另一方面則表現(xiàn)細(xì)胞毒性[1]。正常生理條件下，體內(nèi)ROS的生成與消除呈動態(tài)平衡，故并不對機體造成嚴(yán)重?fù)p害[2]，但當(dāng)ROS水平超過機體的清除能力時，就會發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[3]。NADPH氧化酶是高度表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞中的一種超氧化物代謝酶，也是吞噬細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源[4]。 與骨骼肌安靜時相比，長時間大強度運動所需能量巨大，因此運動時大量氧氣進入線粒體產(chǎn)生大量的ROS。而在此情況下，機體的抗氧化能力不足以平衡ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激的出現(xiàn)，引發(fā)氧化應(yīng)激與線粒體功能喪失的惡性循環(huán)，從而造成骨骼肌及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA的氧化損傷[1]，影響運動能力[5]。為適應(yīng)氧化應(yīng)激，ROS可誘導(dǎo)機體通過多條信號通路產(chǎn)生一系列的抗氧化酶，進而加快ROS的消除[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶系統(tǒng)除誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS外，在活化NF-κB信號通路的過程中亦發(fā)揮了關(guān)鍵作用，故推測該氧化酶系統(tǒng)可能在耐力運動中發(fā)揮潛在調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激水平的效應(yīng)[4]。

NADPH氧化酶系統(tǒng)由6個亞單位組成，其中較大的亞單位gp91phox與較小的p22phox相結(jié)合，形成與膜相連的異二聚體細(xì)胞色素b558，作為NADPH和氧之間最終的電子傳遞 體[7]，而細(xì)胞質(zhì)蛋白 p47phox、p67phox、p40phox與Rac1則可調(diào)節(jié)gp91phox和p22phox的活性，并參與活性復(fù)合體b588的裝配[8]。研究表明，p22phox亞單位與NADPH氧化酶的酶活性相關(guān)，是該氧化酶生成ROS的關(guān)鍵部位，其mRNA表達(dá)的上調(diào)可增加該氧化酶的活性[9]。人p22phox的編碼基因CYBA位于染色體16q24，大小為8.5 kb，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，多個位于外顯子和啟動子區(qū)的SNP位點被報道可影響基因表達(dá)和NADPH的氧化活性[10]。其中，C242T、A930G和A675T多態(tài)位點被研究最多。

C242T多態(tài)性發(fā)生于第4外顯子，C→T多態(tài)可使第72位his被tyr取代，產(chǎn)生一個RsaⅠ酶切位點，而該部位是2個潛在的血紅蛋白結(jié)合位點之一，故C→T突變會降低p22phox與血紅素結(jié)合的能力，從而降低NADPH氧化酶的活性[11]。目前國內(nèi)外對C242T多態(tài)性的研究多限于心、腦血管等大血管病領(lǐng)域，但不同種族、不同研究間得出的結(jié)論差別迥異[12]。Feairheller等[13]研究了有氧運動、高血壓及CYBA多態(tài)性間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激敏感指標(biāo)——尿8-iso-PGF2α的基礎(chǔ)水平在該位點不同基因型攜帶者間差異顯著，其中TT型基礎(chǔ)水平最低，CC型基礎(chǔ)水平最高，且TT型比TC型和CC型攜帶者的血漿總抗氧化能力更好，表明T等位基因具有保護性作用。

多態(tài)位點A930G位于CYBA基因啟動子區(qū)的一個CCAAT/增強子連接蛋白(C/EBP)轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點上。目前已知，該多態(tài)性可導(dǎo)致p22phox亞基的基因轉(zhuǎn)錄活性增加，且G等位基因的轉(zhuǎn)錄活性比A等位基因高30%[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在西班牙、日本和巴西人中，A930G多態(tài)與原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險顯著相關(guān)[7]，在中國人中該多態(tài)則被發(fā)現(xiàn)與缺血性腦血管疾病[15]相關(guān)，而與Ⅱ型糖尿病易感性間未見關(guān)聯(lián)[13]。

多態(tài)位點A675T同樣位于CYBA的啟動子區(qū)[16]，由于該位點位于一個潛在的HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，過量表達(dá)的HIF-1α可提高T等位基因的轉(zhuǎn)錄活性，由此推測T等位基因攜帶者的HIF-1α對p22phox氧化活性發(fā)揮了重要作用[17]，TT基因型則被發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性高血壓及噬菌細(xì)胞內(nèi)p22phox活性均顯著相關(guān)[18]。

綜上，鑒于大量研究已證實NADPH氧化酶系統(tǒng)在運動氧化應(yīng)激中的作用，以及CYBA基因的C242T、A930G和A675T位點對NADPH氧化酶活性具有影響[3]，故本研究選擇這3個位點為目標(biāo)SNP，通過比較優(yōu)秀長跑運動員與普通人群中上述基因多態(tài)的分布特征，探討其作為我國優(yōu)秀長跑運動員選材用分子標(biāo)記的可能性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究分為運動員組和對照組；運動員組選取優(yōu)秀長跑運動員123人(年齡23.1±5.1 歲，身高169.3±7.5 cm，體重55.5±7.5 kg)，均為漢族，運動專項分別為5 km/10 km或馬拉松，運動等級均為健將以上級，來自東北三省、華北五省、河南、山東及安徽北部等地的平原地區(qū)。

對照組招募普通大學(xué)生127名(年齡21.5±1.3歲，身高173.4±4.8 cm，體重64.0±11.6 kg)，均為漢族，均未經(jīng)任何專業(yè)訓(xùn)練，正常參加體育活動，并體檢合格，來自我國東北三省、華北五省、河南、山東等地平原地區(qū)。

為探索性別的影響，將運動員與對照組繼續(xù)分為男性與女性亞組，其中男運動員組62人(年齡24.3±11.9歲，身高175.0±5.1 cm，體重61.5±4.8 kg)，女運動員組61人(年齡20.8±5.3 歲，身高163.5±4.6 cm，體重49.5±4.0 kg)，男對照組71人(年齡20.3±1.3 歲，身高175.0±5.5 cm，體重 69.2±11.2 kg)，女對照組56人(年齡20.0±1.4 歲，身高163.0±5.1 cm，體重57.0±7.7 kg)。為探索運動專項的影響，將運動員分為5 km/10 km與馬拉松組，其中5 km/10 km組31人(年齡22.3±8.6歲，身高170.1±6.3 cm，體重56.2±4.4 kg)，馬拉松組92人(年齡23.5±7.4歲，身高169.0±6.2 cm，體重54.5±6.8 kg)，所有測試對象均知情同意。

1.2 靜脈取血及全基因組DNA提取

常規(guī)方法取外周靜脈血3 ml，分裝后-20℃保存。采用Promega公司基因組DNA純化試劑盒提取全血基因組DNA。

1.3 基因多態(tài)分析

根據(jù)文獻研究報道[5,7-9]和SNP數(shù)據(jù)庫資料，通過HapMap和Haploview軟件分析，選取CYBA基因區(qū)的3個標(biāo)簽SNP位點：C242T、A930G和A675T。

SNP分型由上海邃志生物科技有限公司采用Sequenom公司的Mass ARRAY系統(tǒng)完成。PCR引物和單堿基延伸引物均由Assay Designer(Sequenom)軟件包設(shè)計。以PCR擴增目的片段，采用針對SNP的單堿基延伸引物進行單堿基延伸反應(yīng)。將終止反應(yīng)物脫鹽后點樣到芯片上，并采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF)進行解析，最終結(jié)果由 Mass ARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號 3.0.0.4)實時讀取，并由Mass ARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號 3.4)完成基因的分型分析。

PCR反應(yīng)體系為：DNA樣本1 μl(5 ng/μl)；PCR引物1 μl；dNTP 1 μl(2.5 mmol/L)；MgCl20.325 μl(25 mmol/L)；HotStar Taq酶 0.1 μl；PCR緩沖液0.625 μl；H2O 0.95 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 15 min；94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共45個循環(huán)；最終72 ℃ 3 min。

PCR擴增后，剩余的dNTP被去磷酸。反應(yīng)體系為：H2O 1.53 μl；SAP緩沖液0.17 μl；堿性磷酸酶(Sequenom) 0.3 U。反應(yīng)條件：37℃ 40 min，85℃ 5 min。

單堿基延伸反應(yīng)體系為：H2O 0.755 μl；10×iPLEX緩沖液0.2 μl；終止混合物0.2 μl、iPLEX酶0.041 μl；延伸引物 0.804 μl(10 μmol/L)。單堿基延伸反應(yīng)條件：94℃ 30 s；94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，共40個循環(huán)；最后72℃ 3 min。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析由SPSS 13. 0和SHEsis在線軟件[10]完成。其中，采用χ2檢驗來檢測每個位點的等位基因和基因型頻率，并對運動員組和對照組進行哈溫平衡檢驗。單個SNP在運動員組與對照組分布頻率的差異采用χ2檢驗，不同位點進行兩兩間的LewontinD'和r2計算，并推算位點間連鎖不平衡緊密程度。采用SHEsis軟件對位于強連鎖不平衡區(qū)的位點進行單體型頻率分析。

2 結(jié)果

2.1 CYBA基因多態(tài)位點基因型解析結(jié)果

本研究采用MALDI-TOF技術(shù)對CYBA基因的SNPC242T、SNPA930G和SNPA675T位點基因型分型，檢測成功率在運動員組和對照組中分別為100%及100%、98.4%及100%和100%及100%，取得了良好的分型結(jié)果。

2.2 CYBA基因多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率分布

經(jīng)檢測，優(yōu)秀運動員組和對照組在SNPC242T、SNPA930G和SNPA675T位點的基因型分布均符合H-W平衡(P>0.05)，表明本研究的各組研究對象均具有群體代表性。CYBA基因C242T和A930G單核苷酸多態(tài)位點的基因型和等位基因分布頻率見表1、表2。運動員組與對照組在這兩個多態(tài)位點的基因型和等位基因分布與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。性別分層統(tǒng)計結(jié)果顯示，在不同位點上，男、女運動員組與男、女對照組間的基因型和等位基因分布也均無顯著性差異(P>0.05)。

將運動員按不同運動項目進行分組并與對照組進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在C242T多態(tài)位點，基因型和等位基因在對照組與5 km/10 km組間(χ2=4.71，P=0.03；χ2=4.29，P= 0.04)有顯著性差異，基因型在5 km/10 km組與馬拉松組間(χ2=4.09，P=0.04)也差異顯著，而等位基因在上述二組間雖然差異不顯著，但均有非常顯著的變化趨勢(χ2=3.67，P=0.06)。在A930G位點，各組間的基因型和等位基因頻率則無顯著性差異(P>0.05)。

Tab. 1 The distribution of genotype and allele frequencies of C242T polymorphism in CYBA gene

CG: Controlgroup; EEA: Elite endurance athletes

Tab. 2 The distribution of genotype and allele frequencies of A930G polymorphism in CYBA gene

CG: Controlgroup; EEA: Elite endurance athletes

在A675T位點，運動員組均為AA基因型和A等位基因攜帶者，對照組基因型分布為AA(99%)和AT(1%)，等位基因分布為A(99.6%)和T(0.4%)，各組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 連鎖不平衡和單體型分析

對C242T和A930G位點進行D'和r2計算，結(jié)果顯示，D'和r2值分別為0.309和0.006。經(jīng)計算，主要存在4種單體型(小于0.03的基因型被忽略)。其中，各單體型在男、女對照組、男、女運動員組、男對照組與男運動員組及女對照組與女運動員組間的分布均無顯著性差異(表3)。但單體型TC在對照組與健將組、對照組與5 km/10 km組的分布頻率有顯著性變化趨勢(表4)。

Tab. 3 The distribution of haplotype frequencies ofCYBAgene in EEA and CG of different gender

C242TA930GCGMaleFemaleEEAMaleFemaleCC0.4860.4640.4290.406CT0.4510.4820.7410.504TC0.0000.0270.0460.053TT0.0630.0270.0540.037

CG: Controlgroup; EEA: Elite endurance athletes

Tab. 4 The Distribution of Haplotype Frequencies ofCYBAGene in EEA and CG

CGEliteInternationale EliteMarathon5 km/10 km groupCC0.4680.4220.4050.3830.435CT0.4730.4570.5480.5830.449TC0.0200.052?0.0480.0170.054?TT0.0390.068-0.0170.062

CG: Controlgroup

*P<0.10 TC haplotype in CGvsElite group and in CGvs5 km/10 km group

3 討論

NADPH氧化酶是一類位于內(nèi)皮細(xì)胞及血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞膜上的電子傳遞復(fù)合物，對體內(nèi)信號通路的活化具有一定效應(yīng)，同時也是ROS的主要產(chǎn)生來源，p22phox亞單位則與該氧化酶的酶活性息息相關(guān)[10]。NADPH氧化酶p22phox亞單位由基因CYBA編碼。由于多項研究證實多態(tài)位點C242T、A930G和A675T可影響NADPH氧化酶的活性，因此本研究以這3個多態(tài)位點為研究對象，首次探討了它們與優(yōu)秀有氧耐力間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀長跑運動員與普通人中A930G和A675T位點基因型和等位基因的分布頻率均無顯著性差異(P>0.05)，將運動員按性別和運動項目分組后與對照組比較也未出現(xiàn)顯著性差異，表明這兩個位點與優(yōu)秀有氧耐力素質(zhì)無關(guān)，不能作為優(yōu)秀長跑運動員的分子選材標(biāo)記。而在C242T位點，基因型和等位基因的分布頻率在對照組與5 km/10 km運動員組間差異有顯著性(χ2=4.71，P=0.03和χ2=4.29，P=0.04)。在該項目運動員中，CC基因型和C等位基因均顯著低于普通人，與“T等位基因具有保護性作用”[11]的結(jié)論一致，表明該等位基因攜帶者在運動中受到的氧化應(yīng)激更輕微，抗氧化能力也更好，故可能更利于有氧耐力素質(zhì)的提高。研究還發(fā)現(xiàn)，該位點各基因型分布頻率在不同運動項目的運動員間差異顯著，5 km/10 km組運動員中CC基因型分布頻率顯著低于馬拉松組(77%vs94%)，雖然等位基因在上述二組間的分布頻率無顯著性差異，但表現(xiàn)出非常顯著的變化趨勢(P=0.06)，說明T等位基因?qū)︸R拉松運動員的保護作用有限，該多態(tài)位點的基因型分布具有明顯的項目差異，T等位基因可能是優(yōu)秀5 km/10 km運動員成才的優(yōu)勢遺傳標(biāo)志，故可以考慮將等位基因T作為優(yōu)秀5 km/10 km運動員分子選材的標(biāo)記。但遺憾的是，盡管該結(jié)論與以往研究中關(guān)于T等位基因的保護效應(yīng)相符，但本研究中所有受試者(對照組與運動員組)中均未發(fā)現(xiàn)TT純合子表達(dá)，因此認(rèn)為TC基因型才是北方漢族人中優(yōu)秀5 km/10 km運動員的分子選材標(biāo)記。有研究表明，跑距是影響馬拉松運動員肌肉與淋巴細(xì)胞損傷的重要因素，由于馬拉松運動員在一次訓(xùn)練或比賽中攝入的氧氣約為安靜時的10～15倍，因此產(chǎn)生的ROS比5 km/10 km運動員更多，造成的氧化應(yīng)激也更嚴(yán)重[17]，故推測T等位基因的保護性作用難以平衡長期大強度耐力訓(xùn)練對馬拉松運動員造成的傷害，因此，該組運動員與對照組在該位點的基因型分布無顯著性差異。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，各單體型在對照組與運動員組中的分布頻率差異不顯著。事實上，由于樣本量有限，本研究難以對不同項目、不同等級的運動員群體繼續(xù)分級，因此無法確認(rèn)單體型的分布頻率是否對上述運動員亞群的精準(zhǔn)選材具有實際意義，故未來需要進一步增加樣本量，尤其是對照組的樣本量來進行確認(rèn)。特別需要說明的是，本研究與國內(nèi)外多項研究結(jié)果進行了對比，發(fā)現(xiàn)本研究中的C242T、A930G和A675T位點不同基因型和等位基因頻率與部分研究結(jié)果間均存在顯著差異[7,14,15,18]，但與其他以中國人特別是漢族為研究對象的研究則差異并不顯著[16,19]。有研究者在近期的多項Meta分析中報道稱，C242T多態(tài)性的T等位基因只在亞洲人中與較低的心血管疾病和急性冠脈綜合征風(fēng)險有關(guān)，對歐美人則無保護效應(yīng)，表明種族差異可能是導(dǎo)致各研究結(jié)果間巨大差異的主要因素，而細(xì)胞學(xué)研究則證實C242T多態(tài)性并未造成蛋白質(zhì)局部構(gòu)象的改變，因此該多態(tài)對b558活性復(fù)合體的影響并非功能性的改變，而是通過影響其蛋白成熟度來調(diào)控ROS的生成數(shù)量。此外，鑒于T等位基因在不同種族間分布頻率的巨大差異，迄今為止的相關(guān)meta分析結(jié)論也并不一致，從而表明研究策略、有效樣本量、所研究的多態(tài)位點在目標(biāo)人群中的分布頻率——特別是次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)及研究人群的類型(即是否明確研究基于特定人群)等因素均會在一定程度上影響對多態(tài)性確切生物學(xué)效應(yīng)的判斷。而在本研究中，上述因素也可能是未發(fā)現(xiàn)這3個多態(tài)位點與有氧耐力間確切關(guān)聯(lián)的原因。因此，要解決以上問題，就需要進一步豐富優(yōu)秀耐力運動員的數(shù)量并優(yōu)化基因位點的選擇。而在現(xiàn)階段，本研究的結(jié)論雖然尚未經(jīng)更多研究的檢驗，但CYBA基因作為影響運動員在運動氧化應(yīng)激中適應(yīng)性的重要因素，其多態(tài)性與優(yōu)秀有氧運動能力間的潛在關(guān)聯(lián)值得關(guān)注。鑒于TC基因型對優(yōu)秀5 km/10 km運動員的潛在選材價值與已知C242T多態(tài)性在功能和效應(yīng)機制等方面的自洽，因此有理由相信該多態(tài)與運動員的杰出有氧耐力素質(zhì)相關(guān)，而在更大優(yōu)秀耐力運動員樣本中對TC基因型顯著性的驗證及其選材效果的實證檢驗將是我們未來研究的主要方向。

綜上所述，NADPH氧化酶p22phox亞單位基因的A930G和A675T位點不能作為我國漢族優(yōu)秀長跑運動員的分子選材標(biāo)記，C242T位點的TC基因型可用于優(yōu)秀5 km/10 km運動員的分子選材。