吳文濤， 李梅云， 許姍姍， 薛美靜， 張 靖， 魏環(huán)宇， 王 揚*

1云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201； 2云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，云南 昆明 650021

根結線蟲Meloidogynespp.是分布最廣、危害最重的植物寄生線蟲，已引起世界各國的關注。其中南方根結線蟲M.incognita(Kofold & White) Chitwood、花生根結線蟲M.arenariaNeal和爪哇根結線蟲M.javanicaTreub由于寄主植物多和分布較廣的特點，成為溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)的優(yōu)勢種群，也是當前中國最重要的農(nóng)作物病原線蟲(孟慶鵬等,2004)。由根結線蟲引起的病害遍布全國大部分地區(qū)，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失(劉維志，2000； 趙鴻等，2003)。根結線蟲病為土傳病害，顯癥晚，危害重，極難防治。關于根結線蟲的防治，目前主要采用選育抗性品種、農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學防治和生物防治等手段(孔祥義和陳錦才，2006； 文廷剛等，2008)。由于在作物種植中長期使用化學藥劑會使作物生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和安全性降低，在我國大部分地區(qū)已開始限制使用化學藥劑。因此，選用抗性品種以及生物防治逐漸成為主要手段。

各種根結線蟲之間存在顯著的致病差異，因此對病害發(fā)生區(qū)域的有效防治依賴于對根結線蟲種類準確的檢測和診斷。傳統(tǒng)的根結線蟲的分類鑒定主要是形態(tài)學鑒定和同工酶電泳技術(武揚等，2005)，其中，形態(tài)學鑒定方法主要依靠觀察根結線蟲的外部形態(tài)，包括體長、口針、尾部和會陰花紋等外部可見特征來鑒別。但是，由于許多根結線蟲在外部形態(tài)上相似，要求鑒定者有豐富的經(jīng)驗。同工酶電泳技術雖然可以準確地鑒定根結線蟲的種類，但并不適合土樣當中的根結線蟲的檢測。反轉錄—環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的核苷酸擴增技術(Notomietal.,2000)，與傳統(tǒng)的PCR技術相比，LAMP不需要熱循環(huán)，實驗結果肉眼即可觀察，具有方便快捷、高效和特異性強等特點，目前已在植物線蟲的檢測中得到廣泛應用。Kikuchietal.(2009)、Niuetal.(2012)、Pengetal.(2012)分別建立了松材線蟲Bursaphelenchuhxylophilus、象耳豆根結線蟲Meloidogynespp.、香蕉穿孔線蟲Radopholussimilis的LAMP檢測體系。也有研究表明，利用SCAR引物擴增出的多態(tài)性DNA(RAPD)片段可以鑒定根結線蟲的種類，這些RAPD片段可能代表著物種特異性基因并用于LAMP檢測(Niuetal.,2011)。

本研究根據(jù)3種根結線蟲的SCAR特異性引物對所選擇的根結線蟲的DNA片段進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化、回收并測序。根據(jù)3種根結線蟲的測序結果，針對種類特異區(qū)段，分別設計3種根結線蟲的LAMP引物,并對3種根結線蟲進行檢測，驗證引物的特異性和靈敏度，從而建立一種從罹病植物組織中檢測3種根結線蟲的LAMP快速檢測方法，以期為田間樣本的直接檢測提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

南方根結線蟲從云南永勝的油橄欖上采集，花生根結線蟲從云南建水的煙草上采集，爪哇根結線蟲從云南普文的油藤上采集，3種根結線蟲由本實驗室分類純化，在溫室擴繁保存。

1.2 試劑

rTaqDNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker(寶生物工程)；Bst DNA 聚合酶大片段(NEB公司)；SYBR GreenⅠ(Invitrogen 公司)；蛋白酶 K(Roche公司)。

1.3 線蟲DNA提取

在顯微鏡下挑取單頭供試線蟲放入裝有 10 μL ddH2O的0.2 mL離心管中，加入8 μL的10×PCR buffer 溶液(TaKaRa)、2 μL蛋白酶K溶液，采用凍融法反復凍融6～7次，-80 ℃下保存30 min，65 ℃溫育 90 min，95 ℃反應 10 min，反應完成后，12000 r·min-1離心1 min，上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(萬新龍等，2007)。

1.4 3種根結線蟲種類特異性區(qū)段擴增

分別采用3種根結線蟲的SCAR特異性引物(Zijlstra & Donkers,2000),以基因組DNA為模版，對所選擇的根結線蟲進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化、回收并測序。PCR反應體系：10×Buffer(含Mg2+)5 μL，10 mmol·L-1dNTP 4 μL，引物 rDNA1 和 rDNA2(10 μmol·L-1)各 1 μL，rTaq酶(5 U·μL-1，TaKaRa)2.5 U，模板 DNA 5 μL，ddH2O補足至 50 μL。爪哇和南方根結線蟲的擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，37個循環(huán)；72 ℃ 10 min?；ㄉY線蟲的擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，37個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 LAMP引物設計

根據(jù)3種根結線蟲的測序結果，針對SCAR特異性引物擴增的種類特異區(qū)段，采用PrimerExplorerV4 軟件，分別設計3種根結線蟲的LAMP引物。設計的引物組人工合成后，以提取的純化種群線蟲DNA為模板，分別進行引物組的特異性測試，篩選出分別針對3種根結線蟲的最佳引物組。

1.6 LAMP反應體系的建立

反應體系包括外引物F3和B3各 0.2 μmol·L-1、內引物FIP和BIP各1.6 μmol·L-1、dNTPs(1 mmol·L-1)、20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)、10 mmol·L-1KCl、MgSO4(5.0 mmol·L-1)、10 mmol·L-1(NH4)2SO4、0.1% Triton x-100,8 U Bst DNA聚合酶大片段、1 μL DNA 模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25 μL。混合均勻后，置于60～65 ℃恒溫水浴中保溫45 min，82 ℃保溫 5 min(魏洪巖等，2016)。

1.7 LAMP擴增產(chǎn)物的檢測

LAMP擴增產(chǎn)物檢測采用2種方法。(1)SYBR Green Ⅰ顯色法：LAMP 反應結束后，加入 2 μL 100×SYBR Green Ⅰ，混勻后紫外照射下觀察顏色變化。(2)瓊脂糖凝膠電泳法：取2 μL擴增產(chǎn)物在 2%的瓊脂糖凝膠上電泳，染色，結果在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.8 罹病根組織的LAMP直接檢測

從人工接種南方、花生和爪哇根結線蟲的番茄根系分別取10個根結，將上述罹病根系的根結放入裝有 17.5 μL的 10×PCR buffer的離心管中，加入7.5 μL的蛋白酶 K(600 μg·mL-1)和 25 μL無菌水，混合均勻后離心，放入液氮中速凍，用研磨棒充分搗碎，點動離心后，將離心管放入 65 ℃條件下溫育 90 min，95 ℃下反應10 min，冷卻至室溫，12000 r·min-1離心1 min后的上清液即可作為DNA模板進行 LAMP 試驗和常規(guī) PCR 檢測(何旭峰等，2013)。

2 結果與分析

2.1 3種根結線蟲的特異性引物PCR及測序結果

采用SCAR特異性引物擴增獲得南方根結線蟲DNA序列長度為990 bp，爪哇根結線蟲為720 bp，花生根結線蟲為420 bp(圖1)。將SCAR特異性引物擴增的3種根結線蟲的特異性序列通過blast對比發(fā)現(xiàn)，本研究所用的南方根結線蟲與已報道的南方根結線蟲的SCAR標記特異區(qū)段(JN005841、KP411873)的相似性為99%,花生根結線蟲與已報道的花生根結線蟲的SCAR標記特異區(qū)段(KP234264)的相似性為97%，爪哇根結線蟲與已報道的爪哇根結線蟲的SCAR標記特異區(qū)段(KP087916)的相似性為99%。

圖1 3種根結線蟲的特異性擴增Fig.1 Specific amplification of the three root-knot nematodesA、B、C依次為南方、爪哇 和花生根結線蟲DNA電泳圖。電泳所用Marker大小為2000 bp。 A, B, C: The electrophoretograms of DNA from M. incognita, M. javanica, and M. arenaria. The size of the Marker used was 2000 bp.

2.2 3種根結線蟲的LAMP引物設計

根據(jù)3種根結線蟲的測序結果，針對SCAR引物擴增的種類特異區(qū)段，采用PrimerExplorerV4 軟件，分別設計3種根結線蟲的LAMP引物。每種線蟲各得到4條LAMP引物,包括2條外引物(F3和B3)和2條內引物(FIP和BIP)。具體見表1。

2.3 3種根結線蟲LAMP檢測體系建立

采用優(yōu)化的LAMP擴增體系，分別檢測南方、爪哇和花生3種根結線蟲。3種根結線蟲種群的LAMP擴增產(chǎn)物采用 2種方法均能夠成功檢測：(1)向LAMP反應產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，陽性結果呈現(xiàn)綠色，陰性對照則呈現(xiàn)橘紅色(圖2A、B、C)；(2)LAMP反應產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上分離，陽性結果可見LAMP擴增的特異性的梯形條帶，陰性結果則無條帶(圖2D、E、F)。

表1 南方、花生和爪哇根結線蟲引物序列Table 1 Primer sequences of M. incognita, M.arenaria and M.javanica

圖2 南方、花生和爪哇根結線蟲LAMP 體系建立及擴增產(chǎn)物檢測Fig.2 Detection results of M. incognita, M. javanica and M. arenaria by LAMPA、B、C依次為南方、花生和爪哇根結線蟲的熒光染料檢測結果；D、E、F依次為南方、花生和爪哇根結線蟲的凝膠電泳檢測結果。電泳所用Marker大小為1000 bp。A, B, C: Results of fluorescent dye detection of M. incognita, M. arenaria and M. javanica; D, E, F: Gel electrophoresis results of M. incognita, M. arenaria and M. javanica. The size of Marker used in gel electrophoresis is 1000 bp.

2.4 罹病番茄根組織中3種根結線蟲的LAMP直接檢測

從分別侵染南方、爪哇和花生3種根結線蟲的番茄中隨機采10個根結進行LAMP檢測，結果發(fā)現(xiàn)，南方根結線蟲LAMP檢測的9個根結為陽性(圖3)，花生根結線蟲7個根結顯示陽性(圖4)，爪哇根結線蟲5個根結顯示陽性，PCR檢測結果同步(圖5)。由此確定本研究建立的3種 LAMP檢測體系能夠直接從根結中檢測到南方、爪哇、花生根結線蟲，具有很高的實際應用價值。

圖3 南方根結線蟲的LAMP直接檢測Fig.3 LAMP direct detection of M. incognita A：電泳檢測結果； B：熒光染料檢測結果。 A: The results of electrophoresis detection; B: The results of fluorescent dye detection.

圖4 花生根結線蟲的LAMP直接檢測Fig.4 LAMP direct detection of M.arenaria A：電泳檢測結果； B：熒光染料檢測結果。 A: The results of electrophoresis detection; B: The results of fluorescent dye detection.

圖5 爪哇根結線蟲的LAMP直接檢測Fig.5 LAMP direct detection of M.javanicaA: 電泳檢測結果; B: 熒光染料檢測結果。 A: The results of electrophoresis detection; B: The results of fluorescent dye detection.

3 討論與結論

根結線蟲的鑒定主要分為形態(tài)學鑒定和分子鑒定2種方法，其中形態(tài)學鑒定主要是會陰花紋和同工酶電泳方法，而土壤當中大部分是幼蟲，限制了2種方法的應用。國內外報道的分子鑒定方法主要是PCR-PFLP分析法(王焱等，2007; Powesetal.,1993),但這種方法需要對PCR產(chǎn)物進行酶切，要耗費較多時間，對操作要求較高，不適合快速鑒定。另外一種分子鑒定方法是RAPD-PCR,Bloketal.(1997)利用此方法鑒定了南方、花生、爪哇3種根結線蟲，但RAPD-PCR鑒定過程中對反應條件具有極高的要求(白萬明等,1996; Orui,1999)。而本研究建立的直接從植物根結中檢測南方、花生、爪哇根結線蟲LAMP檢測方法，具有快速、便捷、簡單、特異性等特點。只需要1 h即可完成反應，與常規(guī)PCR相比可以節(jié)省大量時間，實驗過程中不需要PCR儀、凝膠電泳儀和照膠儀，僅使用水浴鍋即可完成檢測，操作較為簡單，通過加入熒光染料，直接用肉眼觀察即可判定結果。但是在反應完成后加入熒光染料的過程中，容易產(chǎn)生氣溶膠，造成實驗室污染和假陽性，影響LAMP檢測結果的準確性，所以應在通風櫥中進行實驗，并在反應液中加入少量石蠟油密封避免假陽性的出現(xiàn)。該檢測方法對3種常見根結線蟲的發(fā)生分布和監(jiān)測具有重要的意義，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很大的應用前景。