雌激素受體亞型及激活蛋白-1在子宮內(nèi)膜息肉中的表達(dá)及意義

董璐 郝曉瑩 王晨

子宮內(nèi)膜息肉(endometrial polyp,EP)是子宮局部內(nèi)膜過度生長所致，數(shù)量可單個或多個，直徑從數(shù)毫米到數(shù)厘米，由子宮內(nèi)膜腺體、間質(zhì)及血管組成的宮腔、宮底部有蒂或無蒂的贅生物。子宮內(nèi)膜息肉是導(dǎo)致異常子宮出血常見的子宮內(nèi)膜病變之一，探討子宮內(nèi)膜息肉發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制從而控制其發(fā)生并預(yù)防其復(fù)發(fā)有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文通過對子宮內(nèi)膜息肉中雌激素受體α (ertrogen receptor-α，ERα)、β(ertrogen receptor-β，ERβ)及激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)組成成分C-jun的表達(dá)進(jìn)行檢測，并與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)進(jìn)行對比，分析子宮內(nèi)膜息肉與ERα、ERβ及C-jun的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討該病的病因機(jī)制提供理論依據(jù)。

對象與方法

1. 研究對象：選取2018年6月—2018年11月本院收治的子宮內(nèi)膜息肉患者，所有患者均經(jīng)宮腔鏡檢查，按照病理標(biāo)準(zhǔn)診斷[1]為子宮內(nèi)膜息肉20例作為實(shí)驗組；同期選擇因異常子宮出血行分段診刮患者，病理診斷為增殖期子宮內(nèi)膜[1]20例作為對照組。入組患者其他標(biāo)準(zhǔn)：(1)無高血壓、糖尿病等內(nèi)科合并癥；(2)月經(jīng)周期正常，無婦科生殖器官疾病如子宮肌瘤、子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜癌、多囊卵巢綜合征等；(3)術(shù)前3個月內(nèi)均無激素用藥史。實(shí)驗組年齡29～48歲，平均(40.4±5.6)歲，對照組年齡27～50歲，平均(40.4±6.3)歲，兩組年齡、孕產(chǎn)次比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在取標(biāo)本時均告知患者，經(jīng)患者同意并簽署知情同意書，該實(shí)驗獲得本院醫(yī)院倫理委員會審核。

2.方法：全部患者標(biāo)本均于月經(jīng)干凈5～14 d行宮腔鏡檢查獲取，檢測并比較兩組標(biāo)本中ERα、ERβ及AP-1組成成分C-jun的含量。

3.標(biāo)本測定：采用免疫印跡法進(jìn)行標(biāo)本測定，步驟如下：標(biāo)本取出后，按每20 mg組織加入250 uL裂解液于勻漿器上充分裂解后取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后儲存于-80 ℃冰箱備用，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，采用12%分離膠和5%濃縮膠，樣品在濃縮膠中電泳電壓80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后增加電泳電壓至120 V，當(dāng)染料到達(dá)膠底部時終止電泳，90 V轉(zhuǎn)膜10 min，5%脫脂奶粉封閉液封閉，4℃過夜。加入1∶1000比例稀釋的一抗，4 ℃過夜，按照1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色儀檢測，TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。實(shí)驗中所需的兔抗人多克隆抗體ERα、ERβ、C-jun，RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液，PBS 磷酸鹽緩沖液，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)均購自武漢Bioswamp生物公司，Tween-20購自Amresco生物公司，PVDF 轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購millipore公司，TEMED，過硫酸銨購自Sigma公司。

4.統(tǒng)計學(xué)分析：采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用pearson相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.ERα、C-jun和ERα/ERβ 在兩組的表達(dá):ERα、C-jun和ERα/ERβ 在子宮內(nèi)膜息肉組中相對表達(dá)量(分別為0.58±0.06、0.81±0.05、1.36±0.26)高于增殖期子宮內(nèi)膜組(分別為0.38±0.01、0.50±0.05、0.59±0.02)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； ERβ在子宮內(nèi)膜息肉組的相對表達(dá)量(0.42±0.05)低于增殖期子宮內(nèi)膜組(0.64±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和圖2。

圖1 兩組組織中ERα、ERβ、C-jun蛋白表達(dá)

圖2 A兩組ERα相對表達(dá)量比較； B兩組ERβ相對表達(dá)量比較；C兩組C-jun相對表達(dá)量比較；D兩組ERα/ERβ相對表達(dá)量比值比較

2.C-jun與ERα/ERβ相關(guān)性分析：子宮內(nèi)膜息肉組C-jun與ERα/ERβ呈正相關(guān)(r=0.524，P=0.018)，增殖期子宮內(nèi)膜組C-jun與ERα/ERβ相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.114,P=0.633)，見圖3。

圖3 A 子宮內(nèi)膜息肉組中C-jun與ERα/ERβ相對表達(dá)量相關(guān)性分析；B增殖期子宮內(nèi)膜組中C-jun與ERα/ERβ相對表達(dá)量相關(guān)性分析

討論

子宮內(nèi)膜息肉是婦科常見疾病之一，根據(jù)不同研究群體的研究報道子宮內(nèi)膜息肉患病率為7.8%～34.9%[2]。子宮內(nèi)膜息肉可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)月經(jīng)量大、經(jīng)期延長、經(jīng)間期出血，也有部分患者僅表現(xiàn)為白帶增多、不孕等癥狀[3]。隨著宮腔鏡技術(shù)的應(yīng)用和水平的提高，EP的檢出率和治療率顯著提高，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前大多數(shù)研究認(rèn)為主要與局部雌激素的過度刺激有關(guān)，但雌激素水平在人體內(nèi)應(yīng)該是相對平衡的，因此單純的用局部雌激素的過度刺激很難解釋其發(fā)生機(jī)制，而局部雌激素受體的高表達(dá)似乎更合理[4]。雖然EP大多數(shù)被認(rèn)為是良性病變，但其惡變的問題不容忽視[5]，主要與年齡、息肉的大小、抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphocytic leukemias Bcl-2)表達(dá)，服用他莫西芬、肥胖、激素替代治療等有關(guān)[6]。

為了更深入闡明子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病機(jī)制，本研究通過免疫印跡法分析了子宮內(nèi)膜息肉與增殖期子宮內(nèi)膜中ERα、ERβ及AP-1組成成分C-jun的表達(dá)。雌激素受體α(ERα)和β(ERβ)兩種亞型介導(dǎo)著雌激素的生理作用。有研究顯示在細(xì)胞的生長和增殖中ERα和ERβ發(fā)揮著相反的作用，ERα作用為促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡，而ERβ表現(xiàn)出了抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[7]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ERβ在子宮內(nèi)膜息肉中含量與其雌二醇濃度和外周血中雌二醇濃度呈正相關(guān)，認(rèn)為高濃度的雌二醇可能是通過ERβ途徑發(fā)揮其生理效應(yīng)，從而導(dǎo)致EP的產(chǎn)生[8]。而沈恒石研究則發(fā)現(xiàn)ERβ的表達(dá)在子宮內(nèi)膜息肉與正常子宮內(nèi)膜中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，子宮內(nèi)膜息肉中ERα的表達(dá)升高，可能是其產(chǎn)生的主要原因[9]，本研究結(jié)果顯示實(shí)驗組中ERα的表達(dá)升高，與沈恒石等的研究結(jié)果相一致。

雌激素可以通過快速激活細(xì)胞膜表面絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases MAPK)等信號通路對其他轉(zhuǎn)錄因子如AP-1進(jìn)行調(diào)控和激活。AP-1是由堿性亮氨酸拉鏈形成高度的保守的同源或異源二聚體,可激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，在眾多的AP-1二聚體中FOS亞型與JUN亞型形成的異源二聚體穩(wěn)定性最強(qiáng)[10-11]，參與到細(xì)胞的增殖、炎癥、凋亡、分化、生存、遷移和轉(zhuǎn)化等過程[12]。并且在對AP-1的激活作用中，ER的亞型、配體的結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的類型都對其產(chǎn)生不同的影響。目前國內(nèi)外對于AP-1在EP中研究報告甚少，AP-1作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子參與了細(xì)胞的增殖、惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、新生血管的形成等過程。在EP的發(fā)生中，新生血管的作用不可忽視，而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的重要的促血管生成因子之一，雌激素受體可以促進(jìn)其表達(dá)，而AP-1也可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移介導(dǎo)VEGF誘導(dǎo)的血管生成[13]。另有在纖維肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型中的研究[14]也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上調(diào)C-jun和JunB時，可以激活增殖蛋白，從而增加血管的生成。本研究結(jié)果顯示在EP中ERα、C-jun的表達(dá)升高，且C-jun與ERα/ERβ比值呈正相關(guān)，提示雌激素可能通過上調(diào)ERα和AP-1參與EP中細(xì)胞增殖、血管生成等過程，與Zhao[15]等人的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜息肉中ERα和ERβ表達(dá)有明顯的差異，ERα可能對其發(fā)揮著更重要的作用。同時，在EP中，C-jun的表達(dá)升高，提示AP-1的激活參與了EP的發(fā)生。但本試驗中選取的病例數(shù)量較少，有待增加臨床病例進(jìn)一步驗證子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病機(jī)制，并為治療、預(yù)防復(fù)發(fā)和控制癌變提供新的方向和依據(jù)。