桑黃提取物體內(nèi)抗腫瘤作用的實驗研究

[摘要]目的通過檢測桑黃3種提取物對H22荷瘤小鼠的抑瘤率，探討桑黃提取物的抗腫瘤活性。方法將SPF級昆明種小鼠隨機分組后，于小鼠右前肢腋窩皮下接種H22肝癌細胞，接種1 d后，分別采用桑黃3種提取物的低、中、高劑量（100、500、1 000 mg·kg-1·d-1）灌胃，以生理鹽水和環(huán)磷酰胺為陰性和陽性對照，連續(xù)給藥10 d。實驗期間每天測定各組小鼠的體質量;給藥10 d后處死小鼠測瘤質量，并計算各組抑瘤率。結果桑黃3種提取物可以增加H22荷瘤小鼠體質量。低、中、高劑量桑黃菌絲體多糖提取物對H22荷瘤小鼠的抑瘤率分別為32.87%、57.08%和68.35%;低、中、高劑量桑黃子實體多糖提取物對H22荷瘤小鼠的抑瘤率分別為44.14%、52.81%和73.69%;低、中、高劑量桑黃發(fā)酵液多糖提取物對H22荷瘤小鼠的抑瘤率分別為49.16%、50.63%和51.81%。結論桑黃3種提取物均具有較強的抗腫瘤活性，其中抗腫瘤效果最好的是桑黃子實體多糖提取物，該提取物也可以顯著增加H22荷瘤小鼠體質量。

[關鍵詞]桑黃;中草藥;肝腫瘤;抗腫瘤藥

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the antitumor activity of Phellinus igniarius extracts by analyzing the tumor inhibition rate of three Phellinus igniarius extracts in H22 tumor`-bearing mice. MethodsSpecific pathogen`-free Kunming mice were randomly divided into groups and then inoculated with H22 hepatoma cells under the axilla of the right forelimb. On day 1 after inoculation， three Phellinus igniarius extracts were administered by gavage at a low dose of 100 mg·kg-1·d-1， a middle dose of 500 mg·kg-1·d-1， and a high dose of 1 000 mg·kg-1·d-1; the mice in the negative control group were given normal saline， and those in the positive control group were given cyclophosphamide. The course of treatment was 10 consecutive days for all groups. Body weight was measured every day， and after 10 d of administration， the mice were sacrificed to measure tumor weight， and tumor inhibition rate was calculated for all groups. ResultsThese three Phellinus igniarius extracts increased the body weight of H22 tumor`-bearing mice. The low`-， middle`-， and high`-dose mycelia polysaccharides from Phellinus igniarius had a tumor inhibition rate of 32.87%， 57.08%， and 68.35%， respectively; the low`-， middle`-， and high`-dose fruit body polysaccharides from Phellinus igniarius had a tumor inhibition rate of 44.14%， 52.81%， and 73.69%， respectively; the low`-， middle`-， and high`-dose Phellinus igniarius polysaccharides extracted from fermentation broth had a tumor inhibition rate of 49.16%， 50.63%， and 51.81%， respectively. ConclusionAll three Phellinus igniarius extracts have a strong antitumor activity， among which fruit body polysaccharides from Phellinus igniarius have the best antitumor effect and can significantly increase the body weight of H22 tumor`-bearing mice.

[KEY WORDS]Phellinus igniarius; drugs， Chinese herbal; liver neoplasms; antineoplastic agents

桑黃為擔子菌門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科的藥用真菌[1`-3]。該菌在我國中南地區(qū)通常生長在桑屬植物上，因其子實體為黃褐色而得名[4`-5]。中國目前發(fā)現(xiàn)的桑黃類群有7種，只有生長在桑樹上的才是真正的桑黃[6]。桑黃作為一種傳統(tǒng)中藥在東亞國家已經(jīng)得到廣泛應用[7]。桑黃味微苦，能利五臟、軟堅、排毒、止血、活血、活胃止瀉，民間用于治療淋病、崩漏帶下等[8`-10]。桑黃是目前國際公認的抗腫瘤效果最好的大型真菌之一[11`-13]。桑黃多糖是桑黃主要的活性成分，可以從桑黃子實體、菌絲體和發(fā)酵液中提取。目前比較桑黃不同提取物體內(nèi)抗腫瘤作用的研究少見。本研究擬通過比較桑黃3種提取物對H22荷瘤小鼠的抑制率，探討其抗腫瘤活性差異，為進一步開發(fā)和利用桑黃提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1樣品桑黃菌絲體多糖提取物、桑黃子實體多糖提取物、桑黃發(fā)酵液多糖提取物均由山東應用真菌重點實驗室提供。將不同多糖提取物溶于蒸餾水制備小鼠灌胃樣品。

1.1.2動物及瘤株SPF級昆明種小鼠由山東大學動物實驗中心提供，體質量（19±2）g，雌雄各半;荷肝癌H22瘤株小鼠由山東省醫(yī)學科學院基礎微生物實驗室提供。

1.1.3儀器及耗材實驗所用的儀器及耗材如下：顯微鏡，百分之一、萬分之一天平，培養(yǎng)皿，一次性使用無菌注射器，小燒杯，量筒，滴管，吸耳球，玻璃棒，血細胞計數(shù)板，蓋玻片，載玻片，膠皮手套，脫脂棉，手術刀，解剖剪，鑷子。

1.2實驗方法

1.2.1分組及稱體質量將66只小鼠隨機裝入11個籠子中，每籠6只，雌雄各半。取9籠小鼠平均分為3組，每組用一種桑黃提取物灌胃，每組3籠小鼠分別設為低劑量組（100 mg·kg-1·d-1）、中劑量組（500 mg·kg-1·d-1）和高劑量組（1 000 mg·kg-1·d-1）;剩余的2籠小鼠分別設為生理鹽水組（陰性對照）和環(huán)磷酰胺組（陽性對照，給予環(huán)磷酰胺20 mg·kg-1·d-1）。每天稱籠中6只小鼠體質量，并分別計算每組小鼠的平均體質量。

1.2.2肝癌細胞采集及計數(shù)用脫脂棉蘸乙醇擦拭H22種鼠腹部，以一次性注射器無菌采集其腹水，用生理鹽水稀釋后，取少量在顯微鏡下計數(shù)，使肝癌細胞密度達到2×109/L。肝癌細胞計數(shù)方法：將潔凈的帶有蓋玻片的計數(shù)板置于顯微鏡下，找到視野，用滴管吸取少許瘤細胞稀釋液從計數(shù)板一側注入，使液體沿兩玻片間滲入，勿使菌液流到蓋玻片或兩邊平臺上，多余的液體用吸水紙吸去，稍待片刻，先置低倍鏡下觀察，找到中央平臺的方格網(wǎng)后，轉換高倍鏡取左上、右上、左下、右下及中央的中格進行計數(shù)。每毫升稀釋液中肝癌細胞數(shù)=每小格平均細胞數(shù)×400×1 000×稀釋倍數(shù)。

1.2.3接種將稀釋并細胞計數(shù)后的腹水分別接種于66只小鼠右前肢腋窩皮下，每只接種0.2 mL。

1.2.4灌胃給藥小鼠接種1 d后開始灌胃給藥，每天每只定時灌胃給藥0.2 mL，連續(xù)給藥10 d。灌胃藥現(xiàn)配現(xiàn)灌，以保持最佳藥效。

1.2.5計算抑瘤率給藥10 d后小鼠稱質量后處死，剖取肝腫瘤組織，計算抑瘤率。抑瘤率=（生理鹽水組平均瘤質量-樣品組平均瘤質量）/生理鹽水組平均瘤質量×100%。1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，所得計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1不同劑量桑黃菌絲體多糖提取物對H22荷瘤小鼠的作用

2.1.1對體質量的影響桑黃菌絲體多糖提取物低劑量組小鼠體質量在前3 d比較穩(wěn)定，第4、5天雖有降低，但是從第6天開始體質量增加，第7天達到峰值;中劑量組小鼠體質量前4 d比較穩(wěn)定，從第5天開始體質量急劇增加，第7天達到峰值;高劑量組小鼠體質量總體上逐漸增加，只是增量較小，比較穩(wěn)定;生理鹽水組小鼠的體質量總體上呈緩慢降低的趨勢;環(huán)磷酰胺組小鼠體質量在前4 d很穩(wěn)定，從第5天開始急劇下降，第10天降至最低。各組間體質量比較，僅環(huán)磷酰胺組在第6～10天時較生理鹽水組顯著下降（F=33.31～101.03，Plt;0.05、0.01），其他組差異均無顯著性（Pgt;0.05）。見圖1。

2.1.2對腫瘤的抑制作用環(huán)磷酰胺組和桑黃菌絲體多糖提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為（71.03±1.71）%、（32.87±6.25）%、（57.08±4.50）%和（68.35±2.50）%。桑黃菌絲體多糖提取物低劑量組和中劑量組的抑瘤率顯著低于環(huán)磷酰胺組（F=214.91，Plt;0.01），而桑黃菌絲體多糖提取物高劑量組的抑瘤率與環(huán)磷酰胺組相比差異無顯著性（Pgt;0.05）。桑黃菌絲體多糖提取物對腫瘤的抑制作用呈一定的劑量效應關系，以高劑量組的抑瘤作用最強。不同劑量桑黃菌絲體多糖提取物的抑瘤率均大于30%，符合國家中醫(yī)藥管理局制定的治療惡性腫瘤中藥的評價標準。

2.2不同劑量桑黃子實體多糖提取物對H22荷瘤小鼠的作用

2.2.1對體質量的影響桑黃子實體多糖提取物低劑量組小鼠體質量總體上呈緩慢增加的趨勢;中劑量組小鼠體質量在前4 d比較穩(wěn)定，從第5天開始突然增加，第8天達到峰值;高劑量組小鼠體質量在前5 d比較穩(wěn)定，從第6天開始增加，第8天達到峰值。桑黃子實體多糖提取物不同劑量組小鼠體質量均有所增加，但是增加量與劑量不呈量效關系，以中劑量組小鼠體質量增加最多。在第3～10天時，與生理鹽水組相比，高劑量組、中劑量組小鼠體質量增加，環(huán)磷酰胺組小鼠體質量降低，差異均有顯著性（F=22.01～149.25，Plt;0.05、0.01）。見圖2。

2.2.2對腫瘤的抑制作用桑黃子實體多糖提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為（44.19±4.81）%、（52.81±4.20）%和（73.69±2.00）%，低劑量組和中劑量組的抑瘤率顯著低于環(huán)磷酰胺組（F=232.33，Plt;0.01），而高劑量組的抑瘤率與環(huán)磷酰胺組相比差異無顯著性（Pgt;0.05）。桑黃子實體多糖提取物對腫瘤的抑制作用呈一定的劑量效應關系，以高劑量組的抑瘤作用最強。

2.3不同劑量桑黃發(fā)酵液多糖提取物對H22荷瘤小鼠的作用

2.3.1對體質量的影響桑黃發(fā)酵液多糖提取物低劑量組小鼠體質量總體上呈緩慢增加的趨勢;中劑量組小鼠體質量于第3天達到峰值，之后維持相對穩(wěn)定;高劑量組小鼠體質量持續(xù)上升，于第10天達到峰值。桑黃發(fā)酵液多糖提取物增加小鼠體質量呈現(xiàn)一定劑量效應關系，以高劑量組小鼠體質量增加最多。各組間體質量比較，環(huán)磷酰胺組在第5～10天時較生理鹽水組下降，高劑量組在第7～10天時較生理鹽水組升高，中劑量組和低劑量組在第10天時較生理鹽水組升高，差異均有統(tǒng)計學意義（F=56.25～169.05，Plt;0.05、0.01）。見圖3。

2.3.2對腫瘤的抑制作用桑黃發(fā)酵液多糖提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為（49.16±4.50）%、（50.63±4.21）%和（51.81±2.90）%，均顯著低于環(huán)磷酰胺組（F=119.80，Plt;0.01），但桑黃發(fā)酵液多糖提取物不同劑量組間比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。不同劑量桑黃發(fā)酵液多糖提取物的抑瘤率均大于30%，符合國家中醫(yī)藥管理局制定的治療惡性腫瘤中藥的評價標準。

3討論

大量實驗研究證實，桑黃對腫瘤細胞有直接抑制作用[14`-16]。桑黃可以抑制腫瘤細胞增殖[17`-19]、增強NK細胞活性[20]、緩解炎癥[21]，在抗氧化[22`-24]、清除自由基[25`-26]、抗肌纖維化[27`-28]、降低血糖[29]方面也有一定的作用。本實驗結果表明，桑黃3種提取物不同劑量均具有明顯抑制H22肝癌細胞生長的作用，其抑瘤率均大于30%，符合國家中醫(yī)藥管理局制定的治療惡性腫瘤中藥的評價標準。有文獻報道，小鼠連續(xù)14 d以500 mg/kg劑量灌胃給予桑黃多糖，對移植性胃癌的抑制率為43.09%，對肉瘤S180的抑制率為46.07%[30]。

在本實驗劑量范圍內(nèi)，對于同種桑黃提取物來說，抗腫瘤作用強度與劑量呈現(xiàn)一定的劑量效應關系，而相同劑量的不同提取物的抗腫瘤效果不同，提示桑黃3種提取物中多糖的種類和含量有差別。應瑞峰等[31]的研究結果表明，桑黃子實體多糖抗腫瘤效果（抑瘤率50%～80%）顯著高于桑黃菌絲體多糖（抑瘤率20%～70%）。本研究中，抗腫瘤作用最強的是桑黃子實體多糖提取物的高劑量組，其抑瘤率為73.69%，與應瑞峰等[31]的研究結果相似。環(huán)磷酰胺雖然對肝癌的抑制效果好，但是由于其對小鼠的殺傷和毒副作用，降低了小鼠的免疫力。本文研究結果為進一步開發(fā)和利用桑黃多糖提取物提供了實驗依據(jù)。

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