shRNA`-Slit2對骨肉瘤MG63細胞遷移、增殖和凋亡影響

[摘要]目的探討人神經(jīng)導向因子2（Slit2）RNA干擾質(zhì)粒（shRNA`-Slit2）對骨肉瘤MG63細胞增殖、遷移和凋亡的影響及其機制。方法構(gòu)建shRNA`-Slit2慢病毒載體，將骨肉瘤MG63細胞隨機分為空白對照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組?？瞻讓φ战M骨肉瘤MG63細胞不轉(zhuǎn)染慢病毒，空白載體病毒組細胞轉(zhuǎn)染含空白質(zhì)粒載體的慢病毒，shRNA`-Slit2載體病毒組細胞轉(zhuǎn)染含shRNA`-Slit2質(zhì)粒載體的慢病毒。分別應用RT`-qPCR、Western`-Blot方法檢測各組Slit2、Robo4以及凋亡因子Caspase`-3和Caspase`-9 mRNA和蛋白的表達，CCK`-8試劑盒檢測骨肉瘤MG63細胞的增殖，Transwell小室實驗檢測細胞遷移，AV`-PI凋亡試劑盒檢測細胞凋亡情況。結(jié)果慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，以骨肉瘤MG63細胞為靶點種子細胞，慢病毒轉(zhuǎn)染率為90%。shRNA`-Slit2載體病毒組Slit2、Robo4 mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于空白載體病毒組，凋亡因子Caspase`-3和Caspase`-9的mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.349～19.989，Plt;0.05）。CCK`-8檢測結(jié)果顯示，空白對照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組細胞增殖率比較差異有顯著性（F=23.983，Plt;0.05）。Transwell實驗結(jié)果顯示，空白對照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組遷移細胞數(shù)比較差異有顯著性（F=31.982，Plt;0.05）。AV`-PI檢測結(jié)果顯示，空白對照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組細胞凋亡率比較差異有顯著性（F=30.009，Plt;0.05）。結(jié)論shRNA`-Slit2可以通過Robo信號通路抑制骨肉瘤MG63細胞增殖及遷移，促進其凋亡。

[關鍵詞]人神經(jīng)導向因子2;骨肉瘤細胞;增殖;遷移;細胞凋亡

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of RNA interference plasmid of Slit2 （shRNA`-Slit2） on the proliferation， migration， and apoptosis of osteosarcoma MG63 cells and its mechanism. MethodsThe lentiviral vector of shRNA`-Slit2 was constructed and osteosarcoma MG63 cells were divided into blank control group， empty virus vector group， and shRNA`-Slit2 virus group. The cells in the blank control group were not transfected with the lentivirus， those in the empty virus vector group were transfected with the lentivirus containing empty plasmid vector， and those in the shRNA`-Slit2 virus group were transfected with the lentivirus containing shRNA`-Slit2 plasmid vector. RT`-qPCR and Western`-Blot were used to measure the mRNA and protein expression of Slit2， Robo4， and apoptotic factors caspase`-3 and caspase`-9; CCK`-8 kit was used to evaluate the proliferation of osteosarcoma MG63 cells， Transwell chamber was used to evaluate cell migration， and AV`-PI kit was used to measure cell apoptosis. ResultsThere was high lentiviral transfection efficiency， and with osteosarcoma MG63 cells as the target seed cells， the lentivirus transfection rate was 90%. Compared with the empty virus vector group， the shRNA`-Slit2 virus group had significantly lower relative mRNA and protein expression of Slit2 and Robo4 and significantly higher mRNA and protein expression of apoptotic factors caspase`-3 and caspase`-9 （F=8.349-19.989，Plt;0.05）. The CCK`-8 assay showed that there was a significant difference in cell proliferation rate between the blank control group， the empty virus vector group， and the shRNA`-Slit2 virus group （F=23.983，Plt;0.05）. The Transwell assay showed that there was a significant difference in the number of migrating cells between the blank control group， the empty virus vector group， and the shRNA`-Slit2 virus group （F=31.982，Plt;0.05）. The AV`-PI assay showed that there was a significant difference in cell apoptosis rate between the blank control group， the empty virus vector group， and the shRNA`-Slit2 virus group （F=30.009，Plt;0.05）. ConclusionShRNA`-Slit2 can inhibit the proliferation and migration and promote the apoptosis of osteosarcoma MG63 cells via the Robo signaling pathway.

[KEY WORDS]Slit2; osteosarcoma cells; proliferation; migration; apoptosis

骨肉瘤多見于年輕人，尤其是20歲以下的青少年和兒童。其惡性程度較高，預后較差[1`-2]。目前，臨床上針對骨肉瘤的治療大多是根治性手術切除加術后輔助化療，給病人及家庭造成巨大的經(jīng)濟負擔和精神負擔[3`-5]。因此，研究骨肉瘤細胞增殖和遷移的發(fā)生機制，尋求新的治療靶點意義重大。Slit是神經(jīng)導向因子家族的一員，它通過與其受體Robo結(jié)合，構(gòu)成Slit`-Robo信號通路，在細胞遷移、炎性反應、腫瘤發(fā)生及器官發(fā)育等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6`-9]。針對人神經(jīng)營養(yǎng)導向因子2（Slit2）基因在骨肉瘤中作用的研究較少。本研究采用慢病毒干擾RNA（shRNA）技術沉默Slit2基因，探討Slit基因以及Robo信號通路在細胞中的作用機制，以期為骨肉瘤的治療提供新的靶點。

1材料與方法

1.1骨肉瘤MG63細胞的培養(yǎng)

本文實驗以骨肉瘤MG63細胞為種子靶細胞，以2×104/cm2的密度將其種植于25 cm×25 cm的培養(yǎng)瓶中，加入含體積分數(shù)0.01胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液（Gibco`-BRL， Gaithersburg， MD），之后將細胞在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2、100%濕度條件下孵育。當細胞融合率為70%～80%時，以2.5 g/L胰蛋白酶消化處理后進行傳代培養(yǎng)。取第2代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2shRNA`-Slit2慢病毒載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染以及細胞分組

載體質(zhì)粒環(huán)狀RNA（LV3）中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamHⅠ酶切后形成的粘端互補;反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoRⅠ酶切后形成的粘端互補。正義連：5′`-GATCC`-（GN18）`-（TTCAAGAGA）`-（N18C）`-TT`-TTTTG`-3′;反義鏈：3′`-G（CN18）`-（AAGTTCTC`-T）`-（N18G）`-AAAAAACTTAA`-5′。將DNA oligo分別采用TE（pH值8.0）溶解，濃度為100 μmol/L。取相應的正、反義鏈oligo溶液，在PCR儀上按照如下程序進行退火處理：95 ℃、5 min;85 ℃、5 min;75 ℃、5 min;70 ℃、5 min;4 ℃保存。得到濃度為10 μmol/L的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 μmol/L，用于連接反應。根據(jù)上述慢病毒轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建原則，構(gòu)建目的基因的shRNA`-Slit2慢病毒（包含插入位點）的ZsGreen熒光蛋白標記基因序列?？寺〉墓押塑账峥梢栽陔x體shRNA中產(chǎn)生pGLV3/H1/ZsGreen+Puro載體（8 kb）。設計的shRNA`-Slit2的引物序列見表1。通過限制映射和DNA測序確定shRNA的成功構(gòu)建。慢病毒載體經(jīng)過36 h的轉(zhuǎn)導后收集并進行離心，清除細胞碎片。慢病毒的效價為5.0×1010 TU/L。

將骨肉瘤MG63細胞隨機分成3組：空白對照組（不轉(zhuǎn)染慢病毒，A組）、空白載體病毒組（轉(zhuǎn)染含空白質(zhì)粒載體的慢病毒，B組）、shRNA`-Slit2載體病毒組（轉(zhuǎn)染含shRNA`-Slit2質(zhì)粒載體的慢病毒，C組）。

1.3實時熒光定量PCR（RT`-qPCR）檢測Slit2、Robo4、Caspase`-3和Caspase`-9的mRNA相對表達水平

將3組骨肉瘤MG63細胞經(jīng)2.5 g/L的胰蛋白酶處理，收集入15 mL離心管， 5 000 r/min離心。取細胞沉淀，加入1 mL的Trizol試劑 （TaKaRa， Japan）裂解細胞，提取細胞總RNA，應用PCR酶標儀檢測其純度，保證提取RNA純度為1.9～2.0，用于后續(xù)實驗。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa， Japan）說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃下保存。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（Perfect Real`-Time， TaKaRa， Japan）說明書的要求進行加樣處理，行RT`-qPCR檢測。根據(jù)預實驗結(jié)果，將反應體系條件設置為：95 ℃、30 s;1個循環(huán)。PCR：95 ℃、5 s;60 ℃、30 s， 40個循環(huán)。溶解曲線：95 ℃、5 s; 60 ℃、1 min。 降溫： 50 ℃、 30 s， 1個循環(huán)。 然后應用FTC`-2000 RT`-qPCR系統(tǒng)分析Slit2、Robo4、Caspase`-3和Caspase`-9的基因表達量。 內(nèi)參基因GAPDH和Slit 2、Robo4、Caspase`-3、Caspase`-9的引物序列均由上海生工公司設計。見表1。采用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量。

1.4Western`-blot檢測Slit2、Robo4、Caspase`-3和Caspase`-9的蛋白表達量

各組骨肉瘤MG63細胞融合率為80%以上時，PBS沖洗3次，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑混合液（100∶1），于冰上裂解1 h，細胞刮刮取細胞，超聲裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液加入上樣緩沖液于95 ℃水浴10 min，-80 ℃保存。BCA比色法測定蛋白濃度，定量上樣進行80 g/L的十二烷基硫酸鈉`-聚丙烯酸胺凝膠（SDS`-PAGE）電泳2.0 h。轉(zhuǎn)膜后加一抗稀釋液（抗體稀釋配比為1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology， 美國） 4 ℃孵育過夜，24 h后用PBS洗膜10 min共3次，后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（抗體稀釋配比為1∶2 000，碧云天，中國） 37 ℃孵育1 h，洗膜，化學發(fā)光試劑顯色1 min，置暗盒內(nèi)，X線顯影、定影后曝光。以β`-actin作為內(nèi)參照。應用Quantity one 4.6軟件測量各條帶的吸光度（A）值，以其表示蛋白含量。

1.5Transwell小室實驗檢測細胞的遷移

將3組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照試劑盒說明書方法，將基底膜的基質(zhì)原液放在冷藏冰箱（4 ℃）過夜融化，然后與預冷的無血清的RPMI`-1640按照1∶3的比例配制侵襲上室凝膠液體，以每孔55 μL的量包被Transwell小室的上室，放置在37 ℃的孵育箱，2 h后使上室成膠。然后，在上室每孔接種200 μL不含血清的細胞培養(yǎng)液，下室加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液500 μL。將Transwell板放置在37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)24 h后用結(jié)晶紫染色，進行細胞計數(shù)。所有實驗均重復3次。

1.6CCK`-8實驗檢測細胞的增殖

收集3組經(jīng)胰蛋白酶消化后細胞，按照CCK`-8試劑盒說明書方法，以每孔50個的量接種在96孔板中，72 h后每孔加入10 μL的CCK`-8試劑，放到37 ℃孵育箱中培養(yǎng)2 h。然后，應用酶標儀分別檢測450 nm波長處吸光度值，每組設置3個復孔。所有實驗均重復3次。

1.7細胞凋亡檢測

收集3組經(jīng)胰蛋白酶消化后細胞，按照AV`-PI試劑盒說明書操作，檢測3組細胞的凋亡率。流式細胞儀分析各組樣本，計算3組細胞的凋亡率。Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡和壞死細胞，Annexin V-/PI+為正常細胞。所有實驗均重復3次。1.8統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結(jié)果用±s形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1shRNA`-Slit2載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

以綠色熒光蛋白（GFP）為熒光探針，完成Slit2的RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建。shRNA`-Slit2載體慢病毒轉(zhuǎn)染滴度為3×1011TU/L，慢病毒轉(zhuǎn)染效率為（91.07±4.33）%。

2.2各組Slit2、Robo4和凋亡基因Caspase`-3、Caspase`-9的mRNA和蛋白表達比較

各組Slit2、Robo4 mRNA和蛋白相對表達量比較差異有顯著性（F=9.007～19.989，Plt;0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組低于空白載體病毒組（q=1.022～5.392，Plt;0.05）。3組Caspase`-3、Caspase`-9 mRNA和蛋白相對表達量比較差異有顯著性（F=8.349～9.078，Plt;0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組高于空白載體病毒組（q=1.997～3.142，Plt;0.05）。見表2。

2.3各組細胞遷移數(shù)比較

Transwell實驗結(jié)果顯示，空白對照組、空白載體病毒組和shRNA`-Slit2載體病毒組遷移細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=31.982，Plt;0.05）;其中shRNA`-Slit2載體病毒組低于空白載體病毒組（q=2.983，Plt;0.05）。見表3。

2.4各組細胞增殖率比較

CCK`-8檢測結(jié)果顯示，空白對照組、空白載體病毒組和shRNA`-Slit2載體病毒組細胞增殖率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.983，Plt;0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組低于空白載體病毒組（q=3.982，Plt;0.05）。見表3。

2.5各組細胞凋亡率比較

AV`-PI檢測結(jié)果顯示，空白對照組、空白載體病毒組和shRNA`-Slit2載體病毒組細胞凋亡率相比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=30.009，Plt;0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組高于空白載體病毒組（q=8.311，Plt;0.05）。見表3。

3討論

骨肉瘤是骨腫瘤科常見的惡性腫瘤，其惡性度比較高，有關研究顯示根治術輔助化療后其5年生存率并沒有明顯的提高[10`-13]。骨肉瘤細胞的惡性增殖以及癌細胞遷移是造成腫瘤病情進展的關鍵原因之一[14`-16]，故了解骨肉瘤細胞增殖、遷移以及凋亡機制具有重要的臨床意義。本文研究探討shRNA`-Slit2基因?qū)侨饬鯩G63細胞增殖、遷移和凋亡的影響及其機制，以期為臨床骨肉瘤的治療提供新的治療靶點。結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2可以通過Robo信號通路抑制骨肉瘤MG63細胞增殖及遷移，促進其凋亡，提示Slit2可以作為骨肉瘤治療的潛在靶點，為臨床上骨肉瘤的治療提供一個新的思路。

Slit是神經(jīng)導向因子家族的一員，它通過與其受體Robo結(jié)合，構(gòu)成Slit`-Robo信號通路，在細胞遷移、炎性反應、腫瘤發(fā)生及器官發(fā)育等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[17`-19]。既往研究顯示，Slit2/Robo4信號通路在炎性遞質(zhì)表達和平滑肌細胞增殖中有促進作用[20`-21]。提示Slit2/Robo4信號通路調(diào)控細胞增殖和凋亡。然而，Slit2/Robo4信號通路在骨肉瘤MG63細胞中的作用尚未見報道。本文研究以慢病毒作為轉(zhuǎn)染媒介，介導siRNA干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞，探討Slit2/Robo4信號通路在骨肉瘤細胞增殖、遷移和細胞凋亡中的作用及其機制。結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染效率均高于90%，說明慢病毒轉(zhuǎn)染具有很好的轉(zhuǎn)染性。RT`-qPCR和Western`-Blot結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組Slit2、Robo4的mRNA和蛋白表達水平低于空白載體病毒組，差異有顯著意義;而凋亡相關因子Caspase`-3、Caspase`-9的表達明顯高于空白載體病毒組，從基因?qū)用婧偷鞍讓用孀C明將Slit2基因沉默后，Robo`-4明顯降低，shRNA`-Slit2可以促進骨肉瘤細胞的凋亡，其作用是通過Robo4信號通路實現(xiàn)的。目前對于腫瘤細胞的行為學特征研究，主要集中于腫瘤細胞的遷移、增殖和凋亡[22`-24]。當然也有的研究聚焦于腫瘤細胞的自噬[25`-26]。而尋求關鍵分子對于腫瘤的行為學影響特點，是分子生物學普遍應用的辦法[27`-28]。如鄭穎等[29]探討鴉膽子素對骨肉瘤的影響，結(jié)果顯示鴉膽子素可以抑制骨肉瘤的增殖，促進骨肉瘤細胞的凋亡，提示鴉膽子素可以作為一種新的骨肉瘤治療藥物。本文的研究結(jié)果則顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組骨肉瘤細胞的遷移數(shù)明顯低于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計學意義，說明shRNA`-Slit2可以明顯抑制骨肉瘤MG63細胞的遷移。本文增殖實驗結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組骨肉瘤細胞的增殖率明顯低于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計學意義，說明shRNA`-Slit2可以明顯抑制骨肉瘤MG63細胞的增殖。AV`-PI凋亡檢測結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組骨肉瘤細胞的凋亡率明顯高于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計學意義，說明shRNA`-Slit2可以明顯促進骨肉瘤MG63細胞的凋亡。另外，本研究還分別檢測了凋亡基因Caspase`-3和Caspase`-9 mRNA和蛋白表達，研究結(jié)果顯示，將Slit2基因沉默表達后，Caspase`-3和Caspase`-9的表達明顯增高。以上結(jié)果表明，Slit2基因在骨肉瘤MG63細胞的遷移、增殖以及凋亡中起重要的作用，可能成為骨肉瘤的潛在治療靶點。

綜上所述，shRNA`-Slit2可以通過Robo信號通路抑制骨肉瘤MG63細胞增殖及遷移，促進其凋亡。為臨床上骨肉瘤的治療提供新的靶點，為骨肉瘤的治療提供新的思路與方法。

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