基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用與偏最小二乘-判別分析的啤酒爽口性評(píng)價(jià)

陳華磊，楊朝霞，王成紅，閆 鵬，張宇昕，李 梅

（青島啤酒股份有限公司 啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100）

爽口性是啤酒口感的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，也是啤酒中多種化合物相互共同作用的結(jié)果。Martina等[1]將啤酒口感歸入除化學(xué)刺激（包括嗅覺與味覺）外由物理化學(xué)多因素作用引起的機(jī)械刺激。Alex[2]也將口感列為觸覺感受。它不像啤酒風(fēng)味中的嗅覺與味覺的研究，可采取外添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法來確定感官感受與風(fēng)味物質(zhì)之間的對(duì)應(yīng)性，從而明確關(guān)鍵風(fēng)味化合物，并進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵過程變化規(guī)律及相關(guān)機(jī)理與風(fēng)味調(diào)控的研究。由于啤酒口感受到多方面因素影響，其物理化學(xué)交互作用顯著，因此上述研究方法并不適用。Miyashita等[3]將啤酒口感中的順滑、脆爽、干凈、回味等感官感受整合為爽口性的概念，通過專用氣相色譜儀分析上百種風(fēng)味物質(zhì)并與品評(píng)結(jié)合，通過偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）法建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)未知啤酒樣品的爽口性進(jìn)行預(yù)測(cè)。在此過程中選擇7 種重要變量（VIP＞1）：辛酸、辛酸乙酯、癸酸、癸酸乙酯、異戊醇、香葉烯、乙酸苯乙酯，其中除異戊醇外其余指標(biāo)均與爽口性呈負(fù)相關(guān)。

頂空固相微萃?。╤ e a d s p a c e s o l i d-p h a s e microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是目前研究食品風(fēng)味的重要手段，廣泛應(yīng)用于葡萄酒[4-6]、啤酒[7-10]及白酒[11-13]等酒精飲料中風(fēng)味物質(zhì)的定性定量研究，并在質(zhì)量控制及食品安全方面也起到了重要作用[14]。PLS-DA基于PLS回歸方法，具有簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[15-24]。

本研究利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)啤酒中7 種有爽口性相關(guān)的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，與品評(píng)結(jié)果一同轉(zhuǎn)化為數(shù)學(xué)矩陣，并利用PLS-DA方法對(duì)其進(jìn)行建模分析，建立一種快速簡(jiǎn)便的啤酒爽口性判定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同生產(chǎn)商及生產(chǎn)日期的77 份Lager啤酒樣品 市購。

標(biāo)準(zhǔn)品（純度）：辛酸（≥98%）、辛酸乙酯（≥98%）、癸酸（≥98%）、癸酸乙酯（≥98%）、異戊醇（≥99%）、香葉烯（≥98%）、乙酸異戊酯（≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；乙醇（分析純）天津恒興化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S Q 8 C GC-M S聯(lián)用儀、D B-5M S毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm） 美國Perkin Elmer公司；PAL COMBI-xt自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯涂層纖維、20 mL帶PTFE涂層硅橡膠墊的頂空瓶 美國Sigma-Aldrich公司；Milli-Q純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及校準(zhǔn)曲線的制定

分別將25 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶于25 mL 5%乙醇溶液中，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于校準(zhǔn)曲線的制定。

1.3.2 HS-SPME樣品制備

取5 mL排氣啤酒樣品置于20 mL頂空瓶中，旋緊瓶蓋，然后將樣品瓶置于自動(dòng)進(jìn)樣器托盤中。分析時(shí)SPME纖維插入樣品瓶的頂空部分，在250 r/min振動(dòng)速率條件下50 ℃萃取40 min，再將纖維插入GC進(jìn)樣口，250 ℃解吸5 min，此過程在自動(dòng)進(jìn)樣器上自動(dòng)完成。

1.3.3 GC-MS測(cè)試條件

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm）；載氣為氦氣，流速1.3 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；程序升溫：40 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫，250 ℃保持1 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；GC-MS接口溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；質(zhì)量掃描范圍29～500 u。被測(cè)組分定性采用全掃描模式，NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索。定量采用選擇離子監(jiān)控模式。

1.3.4 感官品評(píng)

選取8 位有經(jīng)驗(yàn)的啤酒品評(píng)專家組成品評(píng)小組，參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[25]將樣品置于12 ℃恒溫水浴中，并對(duì)77 例啤酒樣品進(jìn)行感官品評(píng)。將品評(píng)結(jié)果分為4 類：爽口性最差的啤酒為1 分，爽口性最佳的啤酒為4 分，并與GC-MS檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，得到相關(guān)化學(xué)信息的關(guān)系矩陣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究對(duì)某啤酒生產(chǎn)企業(yè)于2017年在國內(nèi)11 個(gè)不同生產(chǎn)廠生產(chǎn)的不同原麥汁濃度的啤酒進(jìn)行取樣，共77 例樣品按爽口性品評(píng)結(jié)果分為4 類，GC-MS檢測(cè)數(shù)據(jù)為自變量，將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1進(jìn)行PLSDA。數(shù)據(jù)分析采用軟件MS Workstation 8.0、Microsoft Excel、SIMCA-P 14.1。分析方法過程如下：建立訓(xùn)練集樣本分類變量；對(duì)分類變量和數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA，建立類別判別回歸模型；根據(jù)所建立模型計(jì)算測(cè)試集的分類變量值Yp，Yp＞0.5、偏差＜0.5，判定屬于該類；Yp＜0.5、偏差＜0.5，判定不屬于該類；偏差≥0.5，判別不穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

在收集的77 例樣本中隨機(jī)選取其中50 例為訓(xùn)練集，其余27 例為測(cè)試集。現(xiàn)將50 例樣本作為訓(xùn)練集導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PLS-DA，如表1、2所示。

表1 校準(zhǔn)集樣品信息Table 1 Information about the calibration set of samples

表2 測(cè)試集樣品信息Table 2 Information about the test set of samples

2.1 模型選擇

圖1 主成分分析得分圖（A）和PLS-DA得分圖（B）Fig. 1 Score plots of principal component analysis (A) and PLS-DA (B)

在PLS-DA前先進(jìn)行主成分分析，如圖1A所示，前3 個(gè)主成分對(duì)應(yīng)特征值累計(jì)貢獻(xiàn)率為77.9%，可表征相關(guān)風(fēng)味成分的大部分信息。從圖1A可直觀判斷不同樣品組間區(qū)分還不夠明顯，存在重疊現(xiàn)象；但多數(shù)樣本在95%的置信區(qū)間內(nèi)，說明搜集的樣本本身質(zhì)量穩(wěn)定、分布均勻、模型穩(wěn)健，且實(shí)驗(yàn)操作過程也沒有引入較大誤差。因此，這些數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步的PSL-DA。如圖1B所示，由于同時(shí)使用了X變量與Class分組變量，因此使組間差異明顯改善，較主成分分析能夠更好區(qū)分不同組間的樣本。

2.2 模型建立

由于PLS-DA通過對(duì)變量空間的投影旋轉(zhuǎn)找出類別判別的潛在變量，可有效避免主成分分析中代表樣本類別的方向與方差最大方向不一致的情況。按照樣本類別特征賦予訓(xùn)練集樣本分類變量值。本研究根據(jù)實(shí)際品評(píng)結(jié)果，人工設(shè)置樣本分類變量組，然后利用PLS-DA回歸分析方法對(duì)訓(xùn)練集樣本的7 種爽口性關(guān)鍵風(fēng)味組分與品評(píng)得分進(jìn)行回歸分析，并建立PLS-DA回歸模型。

將50 個(gè)樣本按品評(píng)結(jié)果分為4 組數(shù)據(jù)集作為建模的訓(xùn)練集，其PLS-DA回歸曲線圖的相關(guān)系數(shù)分別為0.861、0.798、0.765、0.812，樣品辨別率為92%，說明模型的擬合較好，具有較高的可靠性，可用于判別未知啤酒樣品的爽口性。

圖2 PLS-DA載荷圖Fig. 2 Loading plot of PLS-DA

如圖2所示，DA（1）、DA（2）、DA（3）、DA（4）分別表示4 組類別變量Y在載荷圖中的位置，Y附近的X變量對(duì)此類別有更高的辨別能力。圖中顯示辛酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸異戊酯等酯類化合物為DA（1）與DA（2）的特征敏感特征變量；而DA（3）的敏感特征變量為辛酸、癸酸與香葉烯。

2.3 模型驗(yàn)證

SIMCA-P采用置換檢驗(yàn)對(duì)PLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證。利用樣本數(shù)據(jù)的隨機(jī)排列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷[26]。它通過對(duì)樣本進(jìn)行順序上的置換，重新計(jì)算統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量，構(gòu)造經(jīng)驗(yàn)分布，然后在此基礎(chǔ)上求出P值進(jìn)行推斷。Y的順序被隨機(jī)地重復(fù)200 次，并且分離的模型被擬合到所有置換的Y中，提取與原始矩陣Y一樣多的分量。

圖3 PLS-DA模型置換驗(yàn)證圖Fig. 3 Permutation validation of the PLS-DA model

Q2為累計(jì)交叉有效性，其值越大表示模型的預(yù)測(cè)能力越好；R2為累計(jì)方差值，表示有多少原始數(shù)據(jù)被用來建立新的PLS-DA判別模型，其值大則表示模型的解釋能力強(qiáng)。由圖3可以看出，左側(cè)的R2和Q2值均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距均為負(fù)值，說明所構(gòu)建的4 個(gè)PLS-DA判別模型均沒有出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象，且都有較好預(yù)測(cè)能力，都能用于各自類別的判別分析。

2.4 模型預(yù)測(cè)

27 個(gè)樣本作為驗(yàn)證集，使用已建立的PLS-DA模型進(jìn)行判別。如表3所示，不同啤酒樣品的爽口性預(yù)測(cè)均方根誤差在0.183～0.523之間，未知樣品的預(yù)測(cè)識(shí)別率為74.07%，說明所建立的PLS-DA模型能很好地預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)未知樣品爽口性。

表3 PLS-DA判別模型分析結(jié)果Table 3 Analysis results with the PLS-DA model

3 結(jié) 論

目前PLS-DA建模方法非常成熟，已應(yīng)用到啤酒分析的各個(gè)方面[27]，其方法簡(jiǎn)單、快捷，解釋能力強(qiáng)。本研究采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)結(jié)合PLS-DA建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型并對(duì)啤酒爽口性進(jìn)行判別，其結(jié)果能夠很好地判別啤酒爽口性的程度。通過外部測(cè)試集驗(yàn)證，該模型具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力，校正集均方根誤差與預(yù)測(cè)均方根誤差參數(shù)均具有較好的預(yù)測(cè)精度，可滿足判斷不同啤酒樣品爽口性的需求。

由于影響啤酒口感的因素眾多，除本實(shí)驗(yàn)涉及的幾種風(fēng)味物質(zhì)外，成品酒中的離子及蛋白[28]的組成，丙三醇、殘?zhí)荹29]和苦味物質(zhì)[30]的含量分布及飲用時(shí)的酒體溫度[31]等因素均會(huì)不同程度地影響啤酒爽口性，因此要更加準(zhǔn)確地判別啤酒爽口性，進(jìn)一步提高模型的準(zhǔn)確性及精度，還需在更大范圍內(nèi)建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。