返魂草藥材提取方法考察與特征圖譜建立

王春馳，周婷婷，紀(jì)圣君，朱迪夫，姜瑞芝，高其品,2*

（1.吉林省吉測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；3.吉林益民堂制藥有限公司，吉林 四平 136001）

返魂草（Senecio cannabifolius Less.）為菊科千里光屬多年生草本植物，以其為原料的制劑如返魂草顆粒（肺寧顆粒）具有清熱祛痰，鎮(zhèn)咳平喘之功效。市場(chǎng)已有多家企業(yè)生產(chǎn)該成藥，臨床廣泛用于治療肺內(nèi)感染，慢性支氣管炎，喘息性支氣管炎，急性呼吸道感染等[1]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，返魂草的主要活性成分為有機(jī)酸和黃酮類，兩類成分均顯示出多種生物活性[2-7]。目前，對(duì)返魂草藥材指紋圖譜的研究的也有報(bào)道[8]，但提取方法暫無水煎-醇超聲法，因此，本研究對(duì)返魂草提取方法進(jìn)行考察，以獲得成分信息反映更加完整的HPLC譜圖，同時(shí)，也對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示Agilet Zorbax SB-C18色譜柱（4. 6 mm×250 mm，5-Micron）分離效果最好，乙腈-0.1%三氟乙酸溶劑系統(tǒng)為流動(dòng)相的色譜峰分布、分離度較好，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm色譜峰最多，響應(yīng)值較高。最后研究建立了返魂草HPLC對(duì)照特征圖譜并確定8個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，為該藥材的質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 LC-2030C 3D高效液相色譜儀（日本島津公司）；BSA224S-CW型電子天平（德國(guó)塞多利斯公司）；KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5A-ws離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 甲醇、乙腈（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；三氟乙酸（長(zhǎng)春三邦醫(yī)藥科技有限公司）；綠原酸對(duì)照品（110753-201716）、金絲桃苷對(duì)照品（11521-201708）、異槲皮苷（11809-201403）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；新綠原酸（B21396）、隱綠原酸（B21587）、異綠原酸A（B21539）、異綠原酸B（B21540）、異綠原酸C（B21541）（上海源葉生物科技有限公司）。共收集了不同產(chǎn)地的返魂草樣品4份，由吉林益民堂制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法考察

2.1.1 水煎法 取藥材粉末（過四號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，煎煮1 h，適時(shí)搖晃補(bǔ)水，放冷，再稱定質(zhì)量，以水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 醇超聲法 取相同藥材粉末置錐形瓶中，精密加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，離心，精密量取上清液2.5 mL置10 mL量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 水煎-醇超聲法 取相同藥材粉末至錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定重量，煎煮1 h，適時(shí)搖晃補(bǔ)水，放冷，稱定重量，以水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，精密加甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理1 h（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 考察結(jié)果 圖1為水煎法、醇超聲法和水煎-醇超聲法提取返魂草藥材的HPLC圖譜，對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，通過水煎法提取返魂草藥材其HPLC圖譜中4、5、6、7、8號(hào)峰較小，醇超聲法提取的返魂草藥材其HPLC圖譜中1、3、6號(hào)峰較小，而通過水煎-醇超聲法提取的樣品其HPLC圖譜中可以看出8個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率均有較大的提高，使整個(gè)圖譜呈現(xiàn)指紋性，更具有信息完整性。故選擇水煎-醇超聲法作為返魂草藥材提取方法從而建立返魂草藥材HPLC特征圖譜。

圖1 三種方法提取返魂草藥材的HPLC圖譜

2.2 色譜條件 Agilet Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5-Micron），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%三氟乙酸（B）溶劑系統(tǒng)，梯度洗脫（0～25 min，8%～18% A，25～ 50 min，18% ～ 22 % A，50～ 55 min，22%～8% A，55～60 min，8%～8% A），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm。進(jìn)樣量10 μL。

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過四號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，至錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定重量，煎煮1 h，適時(shí)搖晃補(bǔ)水，放冷，再稱定重量，以水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，精密加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 參照物溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.3.3 混合對(duì)照品溶液制備 分別取對(duì)照品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C適量，分別加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，得混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，分別于供試品溶液制備后第0、4、8、12、16 h進(jìn)樣，以2號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD范圍分別為0. 41%～0. 52%，0.08%～1.60%。表明供試品溶液在制備后16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取相同供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以2號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD范圍分別為0.04%～0.10%，0.10%～0.30%表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取相同樣品粉末6份，按2.3.1中方法處理，得供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄特征圖譜，以2號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD范圍分別為0. 21%～0. 48%，0.18%～1.15%表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 返魂草藥材的HPLC特征圖譜的建立 按2.2方法記錄4個(gè)不同產(chǎn)地返魂草藥材0～60 min HPLC特征圖譜。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）生成對(duì)照特征圖譜，建立返魂草HPLC對(duì)照特征圖譜，通過與對(duì)照品圖譜比對(duì)（見圖2），指認(rèn)1號(hào)峰為新綠原酸、2號(hào)峰為綠原酸、3號(hào)峰為隱綠原酸、4號(hào)峰為金絲桃苷、5號(hào)峰為異槲皮苷、6號(hào)峰為異綠原酸B、7號(hào)峰為異綠原酸A 、8號(hào)峰為異綠原酸C（見圖3）。

2.6 特征峰相對(duì)保留時(shí)間的確定 返魂草HPLC特征圖譜有8個(gè)特征峰，其中2號(hào)峰為綠原酸，峰面積相對(duì)較大，重復(fù)性好，作為參照峰（S），依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》關(guān)于中藥特征圖譜的規(guī)定，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，在規(guī)定值的5%。將相對(duì)保留時(shí)間的平均值作為規(guī)定值，分別為：0.67（峰1）、1.00（S峰）、1.08（峰3）、2.11（峰4）、2.18（峰5）、2.52（峰6）、2.69（峰7）、3.07（峰8）8個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間，見表1。

圖2 對(duì)照品圖譜

圖3 返魂草藥材的HPLC對(duì)照特征圖譜

3 討論

目前返魂草相關(guān)研究報(bào)道中多采用醇超聲法和索氏提取法[9-13]作為返魂草藥材提取方法，本研究首次選用水煎-醇超聲法提取返魂草藥材并建立了HPLC特征圖譜，該提取方法簡(jiǎn)便且靈敏度高，特征性成分信息完整，可用來全面評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)返魂草藥材的質(zhì)量。本次研究采集了4個(gè)產(chǎn)地的返魂草樣品來考察提取方法進(jìn)而建立HPLC特征圖譜并確定特征峰相對(duì)保留時(shí)間，并不能充分的體現(xiàn)返魂草化學(xué)成分的特性，還有待采集更多樣品進(jìn)行分析。