Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph 在畢赤酵母中的表達(dá)及重組酶酶學(xué)性質(zhì)

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(1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇連云港 222005; 2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇連云港 222005; 3.淮海工學(xué)院海洋資源與環(huán)境學(xué)院,江蘇連云港 222005)

蛋白酶是一種重要的工業(yè)用酶,廣泛應(yīng)用于食品、洗滌劑、醫(yī)藥、皮革、污水處理等多種領(lǐng)域[1-2]。其在水相中主要催化的是肽鍵的水解反應(yīng),而在有機(jī)相中主要催化的是水解反應(yīng)的逆反應(yīng)、肽鍵的合成反應(yīng)[3]。隨著非水酶學(xué)的快速發(fā)展,利用蛋白酶在有機(jī)相中合成小肽已經(jīng)成為一大研究熱點(diǎn),然而大多數(shù)的天然蛋白酶在有機(jī)溶劑容易失活,并且穩(wěn)定性極差,這極大地限制了其在有機(jī)合成領(lǐng)域的應(yīng)用[4]。雖然通過固定化[5-7]、化學(xué)修飾[8]等方法可以提高其有機(jī)溶劑耐受性,但成本高,并且會降低酶活性。獲得天然耐受有機(jī)溶劑的蛋白酶或者通過分子酶工程改造蛋白酶,提高其有機(jī)溶劑耐受性,則可降低成本[9]。

獲得耐有機(jī)溶劑蛋白酶的重組工程菌是研究其有機(jī)溶劑耐受性分子機(jī)制及通過分子酶工程提高蛋白酶有機(jī)溶劑耐受性的前提條件。Ogino等[10]克隆了PseudomonasaeruginosaPST-01所產(chǎn)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶并在E.coli中進(jìn)行表達(dá),獲得分子量約為33.1 kDa的胞內(nèi)酶。朱富成等[11]從P.aeruginosaPT121克隆得到1497 bp蛋白酶基因,并將其在E.coliBL21中進(jìn)行表達(dá),得到約33.0 kDa的重組酶。承龍飛等[12]從蠟樣芽胞桿菌WQ-2中克隆獲得了1701 bp耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因,并將其在枯草芽孢桿菌WB600中進(jìn)行表達(dá),獲得了約為37.0 kDa的具有活性及有機(jī)溶劑耐受性的蛋白酶,且重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶活力比野生菌提高了約4倍,達(dá)到了17400 U/mL。工程菌的構(gòu)建為蛋白酶有機(jī)溶劑耐受性的分子機(jī)制的全面研究以及后期的蛋白改造奠定了良好的基礎(chǔ)。

本研究組篩選得到菌株BacillussphaericusDS11分泌有機(jī)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶,在25%的正己醇、苯、二甲苯等有機(jī)溶劑處理14 d后,仍然保持80%以上的酶活性[13-14]。B.sphaericusDS11蛋白酶基因同B.sphaericus2297蛋白酶基因sph的氨基酸相似度達(dá)到88%[15]。目前,B.sphaericus2297蛋白酶尚未被表達(dá),其有機(jī)溶劑耐受性也未被研究。本研究計(jì)劃全合成B.sphaericus2297sph基因,根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化,并構(gòu)建重組酵母菌P.pastorisX33-ppicZalphA-sph,實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá),對重組酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)和有機(jī)溶劑耐受性研究,為進(jìn)一步探索B.sphaericusDS11蛋白酶的耐有機(jī)溶劑特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliDH5α本實(shí)驗(yàn)室保存;PichiapastorisX33 寶賽生物技術(shù)有限公司(杭州);質(zhì)粒ppicZalphA 美國Invitrogen公司;酵母粉、蛋白胨、NaCl、葡萄糖、甘油、K2HPO4、KH2PO4分析純,國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司;有機(jī)溶劑甲醇、二甲苯、環(huán)己烷、正丁醇、生物素等 阿拉丁試劑有限公司;YNB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;DNA Marker,T4 DNA連接酶,限制性內(nèi)切酶XbaI、ECORI、PmeI,質(zhì)粒小抽試劑盒 寶生物工程有限公司(TaKaRa);B.sphaericus2279蛋白酶基因sphGenBank 登錄號:AJ238598.1。

Q5000微量核酸蛋白檢測儀 美國Quawell 公司;T100TMThermal CyclerPCR儀 美國Bio-RAD公司;凝膠電泳儀 美國Bio-RAD公司;酶標(biāo)儀 南京寶誠生物技術(shù)有限公司;Gel DocTMEZ凝膠成像儀 美國Bio-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶sph基因及引物的合成 將蛋白酶基因sph按畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化,在N端加上His標(biāo)簽,再在C、N端分別加上XbaI、ECORI的酶切位點(diǎn)后,交由南京思普金公司進(jìn)行合成,合成的基因連接到PUC57上寄回。根據(jù)蛋白酶基因sph設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物(上游引物SPH-DR1:5′-ATGGACTCTGAGGACTCTTTGGGT-3′;下游引物SPH-DF1:5′-AGAAGCGTAGTCGTCACCAATAGC-3′),由南京思普金生物公司合成。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將目的基因質(zhì)粒PUC57-sph和載體質(zhì)粒ppicZalphA用ECORI、XbaI進(jìn)行雙酶切,再通過凝膠電泳切膠回收酶切后的目的基因和載體質(zhì)粒,用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接,得到重組質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)化到E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于卡那抗性(50 μg/mL)的LB平板上,37 ℃倒置過夜培養(yǎng),篩選陽性克隆。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR、提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,并將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至生物公司測序,比對測序結(jié)果,將確認(rèn)為陽性克隆的重組質(zhì)粒命名為ppicZalphA-sph。

1.2.3 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建和驗(yàn)證 將重組質(zhì)粒ppicZalphA-sph用限制性內(nèi)切酶PmeI線性化,通過電擊轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞中,將5～20 μg的線性化產(chǎn)物加入到80 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻,轉(zhuǎn)至0.1 cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中,1500 V電轉(zhuǎn),加入1 mL 1 mol/L山梨醇30 ℃培養(yǎng)3 h后,涂布于終濃度為100 μg/μL Zecoin的YPD平板,30 ℃ 培養(yǎng)3 d左右。挑取單菌落,用驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.4 重組畢赤酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 接種轉(zhuǎn)化子于2 mL YPD中,30 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng),以1%的接種量接種100 μL于10 mL BMGY培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為4～8。3000 r/min、1 min離心,收集菌體。棄去BMGY培養(yǎng)基,更換為20 mL BMMY培養(yǎng)基于30 ℃誘導(dǎo)表達(dá),每24 h加入甲醇0.1 mL(甲醇終濃度為50 mL/L,V/V)并取樣,誘導(dǎo)7 d,5000 r/min、15 min離心,收集得到上清粗酶液。由于目的基因合成時添加了His標(biāo)簽,所以使用鎳親和層析柱進(jìn)行純化,得到純酶液。用導(dǎo)入空ppicZalphA的畢赤酵母X33的發(fā)酵液作為對照,將粗酶液、純酶液以及對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE蛋白電泳(濃縮膠電泳電壓50 V,分離膠電泳電壓80 V),來驗(yàn)證目的蛋白是否成功表達(dá)。

1.2.5 蛋白酶活性的測定 本實(shí)驗(yàn)參照福林酚法測定蛋白酶活力[16]。在試管中加入40 ℃預(yù)保溫的1 mL的酶液、1 mL 2% pH8.0的酪蛋白底物,40 ℃水浴反應(yīng)10 min,加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸,靜置10 min,終止反應(yīng)。12000 r/min離心5 min,取1 mL上清液,加入5 mL 0.4 mol/L的碳酸鈉和1 mL的福林酚試劑搖勻,40 ℃顯色20 min,測定上清液的吸光度(A680)。對照組先添加2 mL三氯乙酸,反應(yīng)后再添加酪蛋白底物。酶活單位(U/mL):在特定條件下,每分鐘水解酪蛋白底物產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個酶活單位。

酶活計(jì)算公式:X=A×K×4/10×n

式中:A:樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度;K:吸光常數(shù);4:反應(yīng)試劑的總體積,mL;10:反應(yīng)時間10 min;n:稀釋倍數(shù)。

1.2.6 蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 最適溫度:將酶液與2%酪蛋白底物(pH8.0)混勻后分別置于20、30、40、50、60、70 ℃下反應(yīng)10 min,測定酶液在不同溫度下的酶活力,確定其反應(yīng)的最適溫度。

溫度穩(wěn)定性:將酶液分別在20、30、40、50、60 ℃下保溫2、4、6、7、10 h后,在最適溫度下測定剩余酶活力,以未保溫酶液的酶為對照,對照組酶活定義為100%,確定重組酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.6.2 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 最適反應(yīng)pH:由于不同緩沖體系的緩沖范圍不同,首先配制pH5.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液、pH8.0～9.0的Tris-HCl緩沖液、pH9.0～10.0的甘氨酸-NaOH緩沖液,再用其配制不同pH的酪蛋白底物,再在最適溫度下測定酶液在不同pH下的酶活力,確定其反應(yīng)的最適pH。

pH穩(wěn)定性:用pH5.0～10.0的緩沖溶液分別孵育酶液2、24 h后,在最適溫度和pH條件下測定其剩余酶活力,并以未用緩沖液處理過的酶為對照,對照組酶活定義為100%,確定重組酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.6.3 金屬離子對酶活性的影響 將EDTA作為緩沖液加入酶反應(yīng)體系,使其終濃度為1 mmol/L,將0.1 mol/L的金屬離子CoCl2、KCl、FeCl3、NaCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、BaCl3、CdCl2、SrCl2作為緩沖液加入酶反應(yīng)體系,使其終濃度分別為1、2.5 mmol/L,于最適溫度和pH條件下測定剩余酶活力,以未加入金屬離子條件下測定的酶活力為100%,確定不同金屬離子對酶活力的影響。

1.2.6.4 有機(jī)溶劑對酶活力的影響 將酶液與正丁醇、環(huán)己烷、二甲苯、乙醇等有機(jī)溶劑混勻于30 ℃、180 r/min孵育,有機(jī)溶劑濃度為25%[17],并且在孵育時間為30 min、1 h、2 h、24 h、6 d時取樣,于最適溫度和pH條件下測定剩余酶活力,并以未加有機(jī)溶劑孵育的酶為對照,對照組酶活定義為100%,確定酶液對有機(jī)溶劑的耐受性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個處理重復(fù)3次,用Origin 9.0軟件繪制曲線圖以及分析數(shù)據(jù)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建和驗(yàn)證

將耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因sph插入到畢赤酵母分泌表達(dá)載體ppicZalphA中,得到重組質(zhì)粒ppicZalphA-sph。將重組質(zhì)粒ppicZalphA-sph用限制性內(nèi)切酶PmeI線性化驗(yàn)證,目的基因片段約為1200 bp,質(zhì)粒大小約為3600 bp,圖1中的線性化片段大小與目的基因和質(zhì)粒大小總和相符。再通過電擊轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞中,電擊轉(zhuǎn)化后涂布于平板培養(yǎng)。挑取單菌落用引物SPH-DF1、SPH-DR1驗(yàn)證,得到的片段大小約為1200 bp,與目的基因大小相符(圖2),表明重組畢赤酵母工程菌P.pastorisX33-ppicZalphA-sph構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒ppicZalphA-sphpmeI線性化結(jié)果Fig.1 Recombinant plasmid ppicZalphA- sphpmeI linearization result注:M:DNA Marker;sph:重組質(zhì)粒線性化產(chǎn)物。

圖2 重組酵母菌株P(guān). pastoris X33-ppicZalphA-sph菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Results of PCR identification of recombinant P. pastoris X33-ppicZalphA-sph colonies注:M:DL2000 DNA Marker;1:PCR產(chǎn)物。

2.2 重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明,挑選的轉(zhuǎn)化子能夠在發(fā)酵上清液中測到蛋白酶SPH酶活,誘導(dǎo)7 d后,酶活力最高。對誘導(dǎo)表達(dá)7 d的酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證,表達(dá)產(chǎn)物分子量大小為32.64 kDa,與目的蛋白SPH大小相符(圖3)。

圖3 P. pastoris X33-ppicZalphA-sph誘導(dǎo)表達(dá)上清液SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant P. pastoris X33-ppicZalphA-sph expression注:M:蛋白Marker;1:導(dǎo)入空質(zhì)粒的酵母菌發(fā)酵上清液(對照);2:重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)7 d的上清液; 3:純化后的誘導(dǎo)表達(dá)7 d的上清液。

2.3 重組耐有機(jī)溶劑蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 最適溫度與熱穩(wěn)定性 重組畢赤酵母菌株P(guān).pastorisX33-ppicZalphA-sph經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后得到酶液,進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。從圖4可知,耐有機(jī)溶劑蛋白酶SPH在20～70 ℃內(nèi)均有酶活,隨著反應(yīng)溫度的升高,酶活先升后降。反應(yīng)的最適溫度為40 ℃,在30～50 ℃間具有較高的酶活(最高酶活的80%以上),溫度超過50 ℃后,酶活開始明顯下降,溫度達(dá)到70 ℃時,酶活只剩最高酶活的30%左右。

圖4 溫度對蛋白酶活力的影響Fig.4 Effects of temperature on protease activity

由圖5可以看出,蛋白酶SPH在20、30 ℃下具有良好的穩(wěn)定性,保溫10 h后酶活剩余80%以上;溫度超過40 ℃后,酶的穩(wěn)定性明顯下降,在60 ℃下保溫2 h,酶活下降超過50%,保溫6 h后酶基本失活。

圖5 溫度對蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of temperature on protease stability

2.3.2 最適pH與pH穩(wěn)定性 由圖6可知,耐有機(jī)溶劑蛋白酶SPH在pH5.0～10.0范圍內(nèi)均有酶活,且隨著pH的升高,酶活先升高后降低,其最適反應(yīng)pH為8.0,pH為10.0時,酶活仍能保持70%以上,pH低于7.0時,酶活較低。由此可見,蛋白酶SPH為堿性蛋白酶。

圖6 pH對蛋白酶活力的影響Fig.6 Effects of pH value on protease activity

由圖7可知,用酶的最適反應(yīng)pH8.0的緩沖液處理2、24 h對酶活性影響很小。酸性條件對酶活性影響較大,用pH5.0的緩沖液處理2 h后,酶活下降超過65%,處理24 h后,酶活性下降超過90%。其用pH7.0～9.0的緩沖液處理24 h后,酶活仍能保持在60%以上,說明蛋白酶SPH在弱堿性條件下(pH7.0～9.0)間具有良好的穩(wěn)定性。

圖7 pH對蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH value on protease stability

2.3.3 金屬離子對酶活性的影響 不同金屬離子對酶活力的影響不同,由圖8可知,Co2+、Li+、Na+對酶活力沒有明顯影響;Fe3+、Ba2+對酶活有抑制作用,2.5 mmol/L的Fe3+對酶活的抑制最為明顯,酶活下降60%以上;K+、Sr2+對酶活有明顯的激活作用,尤其是1 mmol/L的K+使酶活提高了50%。

圖8 金屬離子對蛋白酶活力的影響Fig.8 Effects of metal ions on protease activity

2.3.4 有機(jī)溶劑對酶活性的影響 用25%的不同極性常數(shù)的有機(jī)溶劑處理蛋白酶后,酶活力保留情況如表1所示。孵育時間為30 min～2 h時,用二甲苯孵育的蛋白酶酶活力保留率最高,用正丁醇和環(huán)己烷孵育的蛋白酶酶活力保留率無顯著性差異(p>0.05),與其它兩組差異顯著(p<0.05);當(dāng)孵育時間為24 h～6 d時,不同有機(jī)溶劑孵育的蛋白酶酶活力保留率均有顯著性差異(p<0.05)。且蛋白酶SPH在log POW為0.8～3.1之間的有機(jī)溶劑中具有較好的穩(wěn)定性,有機(jī)溶劑處理酶液6 d后剩余酶活力仍能達(dá)到50%以上,而蛋白酶SPH在log POW為負(fù)值的乙醇溶液中,酶活力下降很快,處理6 d后,酶活力僅剩30%左右。Xu等人[18]的研究中,BacilluscereusWQ9-2所產(chǎn)的蛋白酶在37 ℃用50%的log POW為0.05～3.2的有機(jī)溶劑處理24 h后,酶活力保留率達(dá)到90%以上,與本文的重組蛋白酶SPH相比,其在log POW較低的有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性更高;Simkhada等人[19]的研究發(fā)現(xiàn),來源于Streptomycesolivochromogenes的耐有機(jī)溶劑蛋白酶用25%的二甲苯處理3 d后,酶活力保留率僅為82%左右,而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白酶SPH用二甲苯處理6 d后酶活力保留率仍達(dá)到76.8%,對二甲苯有著更好的耐受性。Uttatree等人[20]的研究中發(fā)現(xiàn),來源于Bacillusmegaterium的耐有機(jī)溶劑蛋白酶在log POW大于2.0的有機(jī)溶劑中處理3 d后,酶活力保留率僅為68%左右,而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白酶SPH在log POW大于2.0的有機(jī)溶劑中處理6 d后,酶活力保留率仍達(dá)到72%左右,說明蛋白酶SPH在log POW較大的有機(jī)溶劑中,具有更高的穩(wěn)定性。

表1 有機(jī)溶劑對蛋白酶活力的影響Table 1 Effects of different organic solvents on protease activity

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了蛋白酶SPH的重組酵母菌P.pastorisX33-ppicZalphA-sph,并通過蛋白電泳驗(yàn)證基因sph在畢赤酵母X33中成功表達(dá),對重組蛋白酶SPH的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明,該酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為40 ℃、8.0,且其在較低溫度(20～30 ℃)、弱堿性(pH7.0～9.0)條件下有較好的穩(wěn)定性;Fe3+、Ba2+對酶活有抑制作用,K+、Sr2+對酶活有激活作用;經(jīng)有機(jī)溶劑耐受性驗(yàn)證,重組蛋白酶SPH為耐有機(jī)溶劑蛋白酶。