外切型瓊膠酶AgaO的 高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征

,,,,,,*

(1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東省教育廳特色 農(nóng)產(chǎn)品采后品控與綜合利用重點實驗室,山東濟南 250100; 2.山東大學(xué)國家糖工程技術(shù)研究中心,糖化學(xué)與生物學(xué)山東省重點實驗室,山東青島 266237)

瓊膠主要產(chǎn)自江蘺、紫菜等食用紅藻,與褐藻膠、卡拉膠并稱產(chǎn)量最大、用途最廣的海洋三大多糖,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)。瓊脂糖是瓊膠的主要成分之一,屬中性多糖,分子主鏈由二糖單元(3-6-內(nèi)醚-L-吡喃半乳糖-α-1-3-吡喃半乳糖)通過β-1-4糖苷鍵重復(fù)交替鏈接而成,分子內(nèi)存在α-1-3和β-1-4兩種糖苷鍵類型[1]。

瓊膠酶催化瓊脂糖中糖苷鍵的水解,產(chǎn)生水溶性寡糖產(chǎn)物。因催化位點處糖苷鍵的類型不同,分為α-瓊膠酶、β-瓊膠酶[2]。這兩種酶的寡糖產(chǎn)物分別以3,6-內(nèi)醚-α-L-吡喃半乳糖(A)、β-D-吡喃半乳糖(G)為還原性末端,稱之為瓊寡糖(Agaro-oligosaccharides,AOs)、新瓊寡糖(Neoagaro-oligosaccharides,NAOs)[3-4]。瓊膠酶可用于DNA片段的瓊脂糖凝膠回收以及海藻原生質(zhì)體制備[5-6]。瓊脂糖的降解產(chǎn)物-低聚糖具有抗炎癥[7]、抗氧化[8]、預(yù)防糖尿病[9]、促進(jìn)腸道有益菌群生長[10],以及通過抑制黑色素分泌促進(jìn)皮膚增白[11-12]等重要活性,且未見毒副作用,表明其比瓊脂糖本身具有更大應(yīng)用潛力與更高經(jīng)濟價值。

目前,限制瓊膠寡糖的商品化生產(chǎn)與廣泛應(yīng)用的主要因素之一是制備方法[13]?；瘜W(xué)法雖然工藝簡單、成本低,但反應(yīng)條件劇烈、不易控制,且寡糖產(chǎn)物的分子量不均一,分布范圍廣。與化學(xué)法降解相比,瓊脂糖的酶法降解具有條件溫和可控、污染小且能耗低等綠色環(huán)保、高效的特征[14]。因此,深入挖掘產(chǎn)量大、活性高、穩(wěn)定性強的工具型瓊膠酶資源對于實現(xiàn)瓊膠寡糖的商品化生產(chǎn)至關(guān)重要。課題組前期從海泥樣品中分離到一株瓊膠液化能力強的多糖降解菌-火色桿菌Flammeovirgasp. MY04,其基因組編碼至少15個候選瓊膠酶,可歸類于糖基水解酶的GH16、GH50或GH86家族,無GH96或GH118家族成員[15]。候選瓊膠酶AgaO在基因組編碼產(chǎn)物中無同源蛋白,系統(tǒng)發(fā)育分析表明它與GH50家族的β-瓊膠酶聚類，但序列相似性低于40%[16]。BLASTp在線分析表明,AgaO含有曾定義為GH50家族、現(xiàn)為GH42家族的催化模塊,其催化位點殘基包括Gln458和Gln606等高保守位點。然而,重組酶rAgaO與GH42家族成員不同,無糖苷酶活性;與GH50家族成員相似,是瓊脂糖外切酶,在降解底物糖鏈時專一生產(chǎn)新瓊二糖[16]。因此,瓊膠酶AgaO是MY04菌株降解利用瓊脂(多)糖的關(guān)鍵限速酶,且可用于新瓊二糖的專一性制備。遺憾的是rAgaO的產(chǎn)量較低,易于形成包涵體。因此,為提高外切型瓊膠酶AgaO的表達(dá)效率,本研究優(yōu)化了AgaO的基因密碼子、異源誘導(dǎo)表達(dá)條件,并分析了水溶性重組酶的酶學(xué)性質(zhì)及變化,以期獲得工具酶的高效生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌Trans-T1、大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a(+) 實驗室保存;LB液體培養(yǎng)基(pH7.0)、LB固體培養(yǎng)基(瓊脂粉15 g/L) 實驗室自配;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Prime STAR Max DNA聚合酶 寶生物工程(大連)有限公司;載體pEasy Blunt Cloning Vector、DNA Marker 北京全式金生物科技有限公司;引物、卡那霉素、BCA蛋白測定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司;瓊脂糖 美國Invitrogen公司;Ni-NTA瓊脂糖凝膠 美國Novagen公司;硅膠板 德國Merck公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

DYCP-31DN型核酸電泳儀、DYCZ-24DN型蛋白電泳儀 北京六一儀器廠;Mastercycler nexus梯度PCR儀、5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;GelDoc XR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;DU800分光光度計 美國Beckman公司;-80 ℃超低溫冰箱 日本Sanyo公司;HYG-C恒溫培養(yǎng)振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 EAgaO密碼子的優(yōu)化和人工合成 火色桿菌Flammeovirgasp. MY04(專利保藏號CGMCC 2777)是課題組分離自海泥樣品的1株海洋細(xì)菌,可降解多種多糖,能直接液化瓊脂糖并產(chǎn)生系列新瓊寡糖[15]。通過新一代基因組測序技術(shù)測定了MY04全基因組序列(GenBank登錄號:CP003560-CP003562),并進(jìn)行了初步注釋,發(fā)現(xiàn)存在1個單獨聚類的候選瓊膠酶AgaO。使用軟件BioeEdit7.2.1和SignalP4.0對Flammeovirgasp. MY04瓊膠酶基因agaO序列(GenBank登錄號:KU524066)進(jìn)行序列分析[17-18]。首先除去5′端75 bp信號肽編碼序列,然后參照大腸桿菌菌株的密碼子使用頻率[19],將該基因的密碼子替換為在大腸桿菌中高頻使用的密碼子,結(jié)合考慮(G+C)%含量、密碼子適應(yīng)指數(shù)等因素進(jìn)行綜合優(yōu)化[19-20],并委托上海Invitrogen公司進(jìn)行全基因合成,優(yōu)化后的基因命名為eagaO。

1.2.2 重組表達(dá)載體pET30a-EAgaO的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)eagaO的基因序列設(shè)計引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列為:eagaO-F:gccgCATATGAATCCGCCTAAAAGCATCGATG(劃線部分為添加的NdeI酶切位點),eagaO-R:gccgCTCGAGATTATTCACATTGCCCAGACG(劃線部分為添加的XhoI酶切位點)。PCR擴增后得到基因片段eagaO,連接pEasy Blunt Cloning Vector,轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞,菌液PCR篩選陽性克隆子。將陽性克隆子和pET-30a(+)分別用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切,并經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化后,T4 DNA 連接酶16 ℃過夜連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子,并通過雙酶切及測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行檢測及鑒定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET30a-EAgaO。

1.2.3 瓊膠酶rEAgaO的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET30a-EAgaO轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)宿主細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化后的單克隆至液體LB培養(yǎng)基(50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6～8 h。按1%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接至含100 mL新鮮LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,37 ℃,200 r/min 繼續(xù)振蕩培養(yǎng),至OD600達(dá)到0.6～0.8。向培養(yǎng)基中添加一定量的誘導(dǎo)劑IPTG,在一定溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時間,10000×g、4 ℃離心10 min收集菌體,用Buffer A(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl,pH8.0)洗滌沉淀后,重懸于Buffer A后進(jìn)行超聲破碎,破碎液15000×g、4 ℃離心30 min,二次離心后所得上清即為粗酶液。用BradFord法[21]測定蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.4 重組酶表達(dá)條件的單因素優(yōu)化

1.2.4.1 誘導(dǎo)時間對重組酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響 采用1.2.3的誘導(dǎo)表達(dá)方法,首先使菌體培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8后,添加終濃度為0.1 mmol/L IPTG作為誘導(dǎo)劑,16 ℃分別誘導(dǎo)培養(yǎng)4、8、12、16、20、24 h(不包含加入IPTG前的培養(yǎng)時間)提取粗酶液。測定酶活力大小,以最高酶活力為100%,通過分析計算不同誘導(dǎo)時間下的相對酶活(%),比較分析確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間。

1.2.4.2 誘導(dǎo)溫度對重組酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響 菌體首先在37 ℃培養(yǎng)OD600達(dá)到0.6～0.8后,添加終濃度為0.1 mmol/L IPTG作為誘導(dǎo)劑,然后分別在12、16、20、25、30、35 ℃下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后提取粗酶液。測定酶活力大小,以最高酶活力為100%,通過分析計算不同誘導(dǎo)溫度下的相對酶活(%),分析確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.4.3 誘導(dǎo)劑IPTG終濃度對重組酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響 菌體培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8后,在16 ℃下,分別添加終濃度為0、0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L IPTG,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后提取粗酶液。測定酶活力大小,以最高酶活力為100%,通過分析計算不同誘導(dǎo)劑濃度下的相對酶活(%),分析確定最佳誘導(dǎo)劑IPTG終濃度。

1.2.5 瓊膠酶rEAgaO的純化 按照優(yōu)化后的方案誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,10000×g、4 ℃離心10 min收集菌體,用Buffer A洗滌后,重懸于Buffer A后進(jìn)行超聲破碎,破碎液15000×g、4 ℃離心10 min取上清獲得粗酶液。

由于重組質(zhì)粒pET30a-EAgaO誘導(dǎo)表達(dá)瓊膠酶的N端融合有His標(biāo)簽,本實驗利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠對該融合酶進(jìn)行親和純化。具體步驟如下:取1 mL填料置于10 mL柱子中,待完全沉淀后,先用10 mL ddH2O洗滌,然后加入10 mL Buffer A進(jìn)行平衡;將含有約50 mg總蛋白的酶液加入填料中,輕輕混勻,16 ℃結(jié)合4 h,在重力作用下小心流出液體;隨后分別用1 mL含有咪唑濃度為10、50、100、250、500 mmol/L的緩沖液A進(jìn)行梯度洗脫,優(yōu)化洗脫液咪唑濃度條件,EP管分別收集洗脫液并標(biāo)記。

用BradFord法[21]測定蛋白質(zhì)的濃度。用分離膠濃度為13.2%的SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的純度?；叶葤呙璨⑦M(jìn)行面積積分,分析重組蛋白質(zhì)的相對含量。

將上述經(jīng)檢測含有單一蛋白條帶的樣品液移于透析袋(截留分子量14 kDa),放置于Buffer B(25 mmol/L Tris,5%甘油,pH8.0)中,4 ℃透析連續(xù)透析4次,獲得純酶液以備后續(xù)研究。

1.2.6 酶活測定 配制0.1%(w/v)的瓊脂糖溶液作為底物,向每500 μL底物中添加等體積的酶的稀釋液,混合后水浴反應(yīng)12 h。采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)法[22]測定體系中的還原糖量。酶活力單位(U)定義:每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量為1 U。

1.2.7 瓊膠酶rEAgaO的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.7.1 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定 用100 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(PBS,pH7.0)緩沖液配制0.1%的瓊脂糖,吸取500 μL作為底物,加入500 μL適當(dāng)稀釋的純酶液(對照組為沸水滅活酶液)分別在0、10、20、30、35、40、45、50、60、70 ℃不同溫度下反應(yīng)12 h后,沸水浴10 min終止反應(yīng),測定酶活力,以最高酶活力為100%,確定酶的最適反應(yīng)溫度。

將酶液分別在40、45、50、60、70 ℃不同溫度下預(yù)先保溫0、30、60、90、120 min后,以不經(jīng)過預(yù)處理的酶液酶活定義為100%,測定酶的殘余活力,分析酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.7.2 酶的最適pH及pH穩(wěn)定性測定 分別用濃度為100 mmol/L的NaAc-HAc 緩沖液(pH5、6)、100 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4(PBS)緩沖液(pH6.0、7.0、8.0)、100 mmol/L的Tris-HCl 緩沖液(pH8.0、9.0、10.0),與瓊脂糖配制終濃度為0.10%的瓊脂糖底物,吸取500 μL作為底物,加入500 μL適當(dāng)稀釋的純酶液在45 ℃下反應(yīng)12 h。在上述不同反應(yīng)體系中測定酶的活力,以最高酶活力為100%,確定酶的最適反應(yīng)pH。

將適當(dāng)稀釋的純酶液分別置于50 mmol/L的NaAc-HAc 緩沖液(pH5、6)、50 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4(PBS)緩沖液(pH6.0、7.0、8.0)、50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.0、9.0、10.0)不同pH緩沖體系中,4 ℃預(yù)先放置2 h后,然后在pH7.0、45 ℃條件下反應(yīng)12 h,以未經(jīng)預(yù)處理的酶液的酶活定義為100%,測定酶的殘余活力,分析酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.7.3 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力影響的測定 向純化后的瓊膠酶反應(yīng)體系中添加AgNO3、KCl、LiCl、NaCl、CaCl2、CoCl2、CuSO4、FeSO4、HgCl2、MgSO4、MnSO4、NiSO4、PbAc2、ZnSO4、CrCl3、FeCl3、SDS、Na2EDTA、甘油、β-巰基乙醇、咪唑及DTT不同的金屬離子和化學(xué)試劑,添加的離子終濃度分別為1、10 mmol/L,然后在pH7.0、45 ℃條件下反應(yīng)12 h測定酶的活力,以不添加任何金屬離子和化學(xué)試劑的對照組酶活力為100%,分析金屬離子和化學(xué)試劑對酶活性的影響。

1.2.8 降解產(chǎn)物的分析 按照體積比1∶1混勻瓊脂糖底物和1.2.5制備的純酶液,45 ℃保溫反應(yīng)。隔時取樣,沸水浴10 min使酶失活,離心收集產(chǎn)物,參考薄板層析法[23]使用硅膠板進(jìn)行TLC分析。展開劑及各組分體積比為正丁醇∶乙醇∶水=2∶1∶1,顯色劑為苯胺∶二苯胺∶磷酸∶丙酮=1∶1∶5∶50 (mL∶g∶mL∶mL)。染色后110 ℃加熱10 min使其顯色。所用含有新瓊二糖(Neoagarobiose,NA2)、新瓊四糖(Neoagarotetraose,NA4)和新瓊六糖(Neoagarohexaose,NA6)的分子量標(biāo)準(zhǔn)物是用β-瓊膠酶降解瓊脂糖并純化后的產(chǎn)物,由實驗室自主制備[16,24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗進(jìn)行3次重復(fù),取其平均值,平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的統(tǒng)計分析由Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊膠酶基因eagaO重組表達(dá)載體的構(gòu)建與驗證

首先對密碼子進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的eagaO基因(GenBank收錄號:MG708345)GC含量由35.5%提升至42.5%。以人工合成的eagaO基因片段為模板,使用引物對eagaO-F/eagaO-R經(jīng)PCR擴增后連接到載體pEasy Blunt Cloning Vector,命名為pEB-EAgaO(表1)。重組質(zhì)粒pEB-EAgaO和表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)同時經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切并連接后,獲得重組瓊膠酶rEAgaO的表達(dá)載體pET30a-EAgaO(表1)。該質(zhì)粒的雙酶切驗證結(jié)果顯示:插入的目的片段大小約2100 bp(圖1),與理論分子量一致。

表1 本實驗所使用的重組質(zhì)粒性質(zhì)和來源Table 1 Description and source of the recombinant plasmids used in the present study

圖1 重組質(zhì)粒pET30a-EAgaO雙酶切驗證Fig.1 Identification of the recombinant vector pET30a-EagaO by double restriction enzyme digestion注:M:Trans2K Plus II DNA Marker;1:重組質(zhì)粒 pET30a-EAgaO經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切的產(chǎn)物; 2:質(zhì)粒pET-30a(+)經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切的產(chǎn)物。

2.2 重組酶表達(dá)條件的單因素優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)時間對誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶活的影響 如圖2所示,當(dāng)添加誘導(dǎo)劑后繼續(xù)表達(dá)的時間為4～20 h時,隨時間延長,粗酶液的酶活增加。20、24 h時所獲的酶活力達(dá)到最高值,且無明顯變化。在20 h內(nèi),細(xì)胞的密度和細(xì)胞內(nèi)的水溶性產(chǎn)物都是不斷增加的,在20 h后,由于產(chǎn)物在宿主中已經(jīng)大量積累,導(dǎo)致新產(chǎn)物主要形成包涵體而非水溶性蛋白[25]。因此,從節(jié)約成本和時間的角度考慮,選取20 h為最佳誘導(dǎo)時間。

圖2 誘導(dǎo)時間對誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶活的影響Fig.2 Effects of indution time on the production of enzyme activity

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶活的影響 如圖3所示,溫度在12～16 ℃時,粗酶液的酶活力逐漸升高;當(dāng)溫度為16 ℃時獲得最大酶活力。當(dāng)高于16 ℃時,發(fā)酵液產(chǎn)物酶活力逐漸降低,這是由于較高的溫度可能會導(dǎo)致產(chǎn)物酶活力降低。則16 ℃為瓊膠酶rEAgaO的最適誘導(dǎo)表達(dá)溫度。

圖3 誘導(dǎo)溫度對誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶活的影響Fig.3 Effects of indution temperatures on the production of enzyme activity

2.2.3 IPTG濃度對誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶活的影響 如圖4所示,在IPTG終濃度為0.1～0.7 mmol/L時所得粗酶液的活力沒有明顯差異;所添加IPTG終濃度繼續(xù)加大后,粗酶液的活力開始下降。IPTG自身對大腸桿菌有一定的毒性,因此IPTG高于一定濃度后,表現(xiàn)出生長抑制作用而導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降。從節(jié)約成本的角度考慮,選擇IPTG終濃度為0.1 mmol/L時為最佳誘導(dǎo)劑添加濃度。

圖4 IPTG濃度對誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶活的影響Fig.4 Effects of IPTG concentrations on the production of enzyme activity

2.3 瓊膠酶rEAgaO的分離純化

SDS-PAGE檢測分析初步表明,在最優(yōu)條件下重組酶rEAgaO在大腸桿菌內(nèi)實現(xiàn)了高效表達(dá)?；叶葤呙韬兔娣e積分表明,在可比條件下,水溶性組分中重組蛋白的含量是水不溶組分中含量的19.2倍,表明95%以上重組蛋白為水溶性表達(dá),這比原始基因表達(dá)產(chǎn)物中的含量(30%[16])提高了2.2倍。結(jié)果表明,當(dāng)洗脫液中咪唑濃度為250 mmol/L時,可洗脫得到單一的蛋白條帶。如圖5所示,純化后的目的蛋白大小約為81.3 kDa,分子量與目標(biāo)蛋白理論分子量相符。根據(jù)菌體水溶性蛋白質(zhì)的總濃度及目標(biāo)蛋白含量推算,rEAgaO的發(fā)酵產(chǎn)量約為1432.7 mg/L,這比rAgaO的發(fā)酵產(chǎn)量(0.12 g/L[16])提高了10.9倍。純化所得重組酶的純度>95%,得率約為85.7%,活力為910.2 U/mg，比rAgaO的酶活(185 U/mg)[16]提高了近4倍。

圖5 瓊膠酶rEAgaO表達(dá)和純化的SDS-PAGE檢測Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression and purification of agarase rEAgaO

2.4 瓊膠酶rEAgaO的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 溫度對rEAgaO活性及穩(wěn)定性的影響 溫度會影響酶蛋白分子的穩(wěn)定性,溫度過低,酶活性降低,溫度過高會使酶蛋白變性失活。如圖6所示,瓊膠酶rEAgaO在45 ℃反應(yīng)時具有最高的相對酶活,表明rEAgaO的最適反應(yīng)溫度是45 ℃,明顯高于瓊膠的凝固溫度(40 ℃),有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行,降低了反應(yīng)成本。如圖7所示,rEAgaO酶活性在40、45、50、60 ℃具有較好的穩(wěn)定性,保溫2 h,酶活仍保持66%以上(分別為90.4%、83.5%、77.9%、66.3%)。70 ℃酶活急劇下降,保溫1 h酶活僅為最高值的5.2%,至1.5 h已檢測不到酶活。說明該酶具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖6 溫度對瓊膠酶rEAgaO活性的影響Fig.6 Effects of temperature on agarase rEAgaO activity

圖7 溫度對瓊膠酶rEAgaO熱穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperature on thermal stability of agarase rEAgaO

2.4.2 pH對rEAgaO活性及穩(wěn)定性的影響 pH會影響酶蛋白分子與底物的結(jié)合,過酸或者過堿都會使酶變性失活。如圖8所示,以瓊脂糖為底物測定酶活時,隨著pH的升高,瓊膠酶rEAgaO的酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,pH7.0時,相對酶活力最高。在pH6.0～10.0范圍內(nèi)4 ℃處理2 h,rEAgaO的殘余酶活在69.5%以上,顯示該酶具有廣泛的pH穩(wěn)定性(圖9)。

圖8 pH對瓊膠酶rEAgaO活性的影響Fig.8 Effects of pH on agarase rEAgaO activity

圖9 瓊膠酶rEAgaO pH穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of agarase rEAgaO

2.4.3 金屬離子及化學(xué)試劑對rEAgaO活性的影響 不同的金屬離子和化學(xué)試劑對瓊膠酶rEAgaO的酶活力影響不同,如圖10所示,實驗的大多數(shù)金屬離子對rEAgaO都有不同程度的抑制作用,例如Ag+、Co2+、Cr3+;化學(xué)試劑SDS、EDTA、咪唑、β-巰基乙醇及DTT也都對rEAgaO的酶活具有不同程度的抑制作用;其他金屬離子,如Na+、K+、Ca2+等在海水中含量豐富的離子,對該酶的活性影響均不大,可能與該酶產(chǎn)生菌來源于海洋生境有關(guān);相比之下,10 mmol/L的Mg2+對rEAgaO的活性有明顯促進(jìn)作用,可使酶活提高至118.8%。

圖10 金屬離子和化學(xué)試劑對瓊膠酶rEAgaO活性的影響Fig.10 Effects of metalic ions and chemicals on agarase rEAgaO activity

2.5 降解產(chǎn)物的分析

聚合度相同的新瓊寡糖和瓊寡糖在TLC分析中的展開系數(shù)Rf明顯不同。如圖11結(jié)果顯示新瓊寡糖的帶型清晰,測得新瓊寡糖標(biāo)準(zhǔn)物中新瓊二糖(NA2)、新瓊四糖(NA4)和新瓊六糖(NA6)的Rf值分別為0.57、0.42和0.28。將瓊膠酶rEAgaO和瓊脂糖底物反應(yīng)12、24 h,TLC分析降解產(chǎn)物中僅含有與新瓊二糖NA2 Rf值一致的寡糖。這表明,與rAgaO相似,rEAgaO仍然是以NA2為主產(chǎn)物的外切型瓊膠酶[16]。

圖11 瓊膠酶rEAgao降解瓊脂糖的產(chǎn)物分析Fig.11 Analysis of the hydrolysis products of agarose by agarase rEAgaO

3 結(jié)論

以大腸桿菌為宿主的原核表達(dá)系統(tǒng),因遺傳背景清晰、操作簡單、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點備受青睞。目前,已有多個不同物種來源的瓊膠酶基因在大腸桿菌中成功表達(dá)[24,26-27],但卻少見高效表達(dá)與商品化生產(chǎn)。本研究參照大腸桿菌的密碼子使用頻率,用高頻密碼子將火色桿菌Flammeovirgasp. MY04來源外切型瓊膠酶基因agaO進(jìn)行優(yōu)化,并將GC含量由35.5%提升至42.5%,最終人工合成獲得基因片段eagaO。所構(gòu)建的表達(dá)載體,去除了野生型信號肽的編碼序列及載體所固有的信號肽編碼序列。經(jīng)過蛋白質(zhì)表達(dá)、純化與性質(zhì)鑒定、生化特征分析表明,與用原始基因agaO構(gòu)建的載體pBAgaO所表達(dá)的重組酶rAgaO相比[16],rEAgaO的最適溫度(45 ℃)和最適pH(7.0)沒有變化。但是,可比條件下,rAgaO在0～40 ℃環(huán)境中預(yù)處理2 h,表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性[16],而密碼子改造后的rEAgaO在更寬的溫度范圍(0～60 ℃)表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性(圖7);rAgaO在pH6.0～8.0的環(huán)境中預(yù)處理2 h,表現(xiàn)出pH穩(wěn)定性[16],而rEAgaO在更寬的pH范圍(6.0～10.0)內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定性(圖9)。而酶學(xué)性質(zhì)分析表明:在最適條件下,rAgaO的酶活是185 U/mg[16],而rEAgaO的酶活是910.2 U/mg,比rAgaO提高了近4倍。與rAgaO相同,rEAgaO降解瓊脂糖時的主產(chǎn)物始終是新瓊二糖(圖11)。研究者認(rèn)為,盡管最適溫度、最適pH、寡糖生成特性等特征沒有因為基因密碼子的改造而發(fā)生變化,但是水溶性重組酶的產(chǎn)量與酶活大幅提高,使得應(yīng)用密碼子優(yōu)化后基因片段來高效表達(dá)、商品化生產(chǎn)外切型瓊膠酶rEAgaO成為可能。這更有利于二糖外切型瓊膠酶rEAgaO作為一種工具酶進(jìn)行推廣應(yīng)用。