蠐螬酶法制備抗氧化活性肽

張海英，李秀梅，潘方方，楊培龍，俞曉亭，石冬冬，*，馬文建，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100181）

蠐螬（Protaetia brevitarsis）是東亞地區(qū)一種經(jīng)典的民間藥材，它含有多種人類所需的氨基酸和無(wú)機(jī)元素，臨床上用于促進(jìn)血液循環(huán)已有數(shù)百年歷史。近年來(lái)人們也對(duì)蠐螬進(jìn)行了更深入的科學(xué)研究。現(xiàn)代藥理研究表明蠐螬具有抗腫瘤、保肝、治療口瘡、小兒哮喘、中風(fēng)、血吸蟲(chóng)病肝硬化等多種藥物活性，是一種極具研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥材[1]。Xu 等發(fā)現(xiàn)了蠐螬的粗提物的抗凝活性，且其中的幾種纖維蛋白（原）溶解劑具有抗血栓作用[2]；研究表明蠐螬的乙醇和石油醚提取物具有優(yōu)異的抗真菌活性[3]。蠐螬在韓國(guó)還被用于治療慢性肝硬化，Oh 等研究發(fā)現(xiàn)它可以降低肝細(xì)胞損傷的程度[4]。

隨著越來(lái)越多的蛋白質(zhì)水解物被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化能力，新型抗氧化肽不斷的被開(kāi)發(fā)。抗氧化肽具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力和螯合金屬離子的能力，還能夠清除生物體內(nèi)過(guò)量自由基。資源昆蟲(chóng)養(yǎng)殖的興起，使昆蟲(chóng)抗氧化肽的研究也隨之增多，采用雙酶水解黃粉蟲(chóng)蛋白粉純化得到的抗氧化多肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基具有很強(qiáng)的清除作用，清除率可分別達(dá)到74.20%和87.32%[5-6]。研究表明大麥蟲(chóng)各蛋白組分均有體外抗氧化作用，隨著濃度的增大，各蛋白液的總還原能力、對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力也隨之增強(qiáng)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白具有較好的水解效果，其水解產(chǎn)物有較高抗氧化活性，對(duì)DPPH·、超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）都具有較強(qiáng)的清除能力[9-10]。然而，蠐螬作為重要的昆蟲(chóng)資源之一，其蛋白水解物抗氧化作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性易受原料蛋白理化特性、選用酶的種類、水解程度等因素的影響。本研究以蠐螬為試驗(yàn)材料，以蠐螬多肽提取率及其抗氧化能力為衡量指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，從控制酶種類、酶蟲(chóng)比、底物濃度、水解體系pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化能力的影響，最終確定蠐螬抗氧化多肽的適宜提取條件，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳酶解工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠐螬：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院河北廊坊基地，經(jīng)鑒定為金龜科白星花金龜Protaetia brevitarsis的幼蟲(chóng)；脂肪酶（≥3 000.0 U/g）、胰蛋白酶（≥50 000 U/g）、酸性蛋白酶（≥50 000 U/g）、中性蛋白酶（≥60 000 U/g）：沃凱化工科技有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：碧云天生物技術(shù)公司；LGJ-18 真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SHZ-B 水浴恒溫振蕩器：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；Sigma 3K15 離心機(jī)：北京科普順科技有限公司；新型T18 高速分散機(jī)：上海捷滬儀器儀表有限公司；FE-28 pH 計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Synergy H1 酶標(biāo)儀：北京京科瑞達(dá)科技有限公司；KjeltecTM8400 凱氏定氮儀：福斯華（北京）科貿(mào)有限公司。Folin-酚試劑：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

取數(shù)只洗干凈的蠐螬，放入100 ℃的開(kāi)水中約40 s，立刻取出，將水擦干，放入-20 ℃冰箱內(nèi)，保存至備用。準(zhǔn)確稱取10 g 蠐螬，按所需底物濃度加入溶液，用轉(zhuǎn)速為8 000 r/min 高速分散機(jī)勻漿，得到蟲(chóng)漿液。加入所需要的酶，放在水浴恒溫振蕩器中，150 r/min，45 ℃酶解3 h。放在70 ℃的水浴恒溫振蕩器中滅活30 min，4 ℃靜置過(guò)夜。4 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，冷凍干燥后，用凱氏定氮法測(cè)量肽的含量。

1.2.2 酶的選擇

酶解法制備抗氧化肽是利用酶把蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂，產(chǎn)生肽段。如，酶解鷹嘴豆制備抗氧化肽[11]，酶解獲得魚(yú)肽[12]、酶解獲得骨膠原蛋白肽[13]等。本研究在底物濃度5%、酶蟲(chóng)比0.6%，酶解3 h 的條件下，分別考察脂肪酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)蠐螬多肽提取率及總抗氧化能力的影響，確定適宜的蠐螬蛋白水解酶種類。4種酶的酶解最佳條件見(jiàn)表1。

表1 4種酶酶解最佳條件Table 1 Four enzyme digestion optimum conditions

1.2.3 工藝參數(shù)的確定

根據(jù)篩選出的最優(yōu)酶，以蠐螬多肽提取率及其總抗氧化能力為衡量指標(biāo)，考察酶蟲(chóng)比、底物濃度、酶解時(shí)間、水解體系pH值和酶解溫度對(duì)衡量指標(biāo)的影響。

1.2.3.1 酶蟲(chóng)比的篩選

在55 ℃，酶解時(shí)間3 h，底物濃度5%，水解體系pH 5 條件下，酶蟲(chóng)比分別為0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，測(cè)定各衡量指標(biāo)。

1.2.3.2 底物濃度的篩選

在55 ℃，酶解時(shí)間3 h，酶蟲(chóng)比0.6 %，水解體系pH 5 的條件下，底物濃度分別為20%、10%、7%、5%、4%，測(cè)定各衡量指標(biāo)。

1.2.3.3 水解體系pH值的篩選

在55 ℃，酶解時(shí)間3 h，酶蟲(chóng)比0.6%，底物濃度5%的條件下，水解體系pH值分別為4、5、6、7、8，測(cè)定各衡量指標(biāo)。

1.2.3.4 酶解時(shí)間的篩選

在55 ℃，水解體系pH 5，酶蟲(chóng)比0.6%，底物濃度5%的條件下，酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，測(cè)定各衡量指標(biāo)。

1.2.3.5 酶解溫度的篩選

在酶解時(shí)間3 h，酶蟲(chóng)比0.6%，底物濃度5%，水解體系pH 5 的條件下，酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃，測(cè)定各衡量指標(biāo)。

1.2.3.6 最佳工藝條件的選擇

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)法，以底物濃度、水解體系pH值、酶解溫度作為3 個(gè)考察因素，選取3 個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。采用L9（33）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，來(lái)確定蠐螬多肽提取以及總抗氧化能力的最佳工藝條件。

1.2.4 蠐螬多肽含量的測(cè)定

蠐螬總蛋白含量的測(cè)定根據(jù)GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法檢測(cè)，蠐螬水解液中多肽的含量測(cè)定依據(jù)Folin-酚法檢測(cè)[14]。多肽提取率的計(jì)算公式為：

多肽提取率/%=蠐螬多肽含量/蠐螬總蛋白質(zhì)量×100

1.2.5 總抗氧化能力的測(cè)定

根據(jù)總抗氧化能力試劑盒（FRAP 法）的方法測(cè)定。將酶解液稀釋一定倍數(shù)后，4 000 r/min 離心15 min，依次加入5 μL 待測(cè)樣品，150 μL TPTZ 稀釋液、15 μL TPTZ 溶液和15 μL 檢測(cè)緩沖液于96 孔板中，輕輕混勻。37 ℃孵育3 min～5 min 后，在593 nm 處用酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響

由于酶的酶切位點(diǎn)不同，酶解產(chǎn)物會(huì)有不同的生物活性?？疾?種酶對(duì)蠐螬多肽提取率及抗氧化能力的影響，結(jié)果如圖1 和圖2所示。

圖1 酶種類對(duì)蠐螬多肽提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme types on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva

脂肪酶酶解得到的蠐螬多肽提取率較高，可達(dá)到8.70%，同時(shí)，其具有較強(qiáng)的抗氧化能力，抗氧化能力為0.501 mmol/L?？梢?jiàn)，脂肪酶是制備蠐螬抗氧化肽的較適合的酶。

2.2 酶蟲(chóng)比對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響

酶蟲(chóng)比對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

從圖可知，其它條件不變，隨著酶蟲(chóng)比的增大，蠐螬多肽得率稍有增加，在酶蟲(chóng)比為0.60%時(shí)，蠐螬多肽提取率可達(dá)到最大值10.79%；當(dāng)酶蟲(chóng)比繼續(xù)增大，蠐螬多肽提取率下降，這是因?yàn)槊柑砑恿吭酱螅概c底物接觸越充分，酶解越佳，但當(dāng)添加到一定量后，酶與底物結(jié)合為飽和狀態(tài)，繼續(xù)添加酶效果不明顯[15]；隨著酶蟲(chóng)比的增大，測(cè)得鮮蟲(chóng)多肽抗氧化能力不一定增強(qiáng)，在酶蟲(chóng)比為0.60%時(shí)，測(cè)得鮮蟲(chóng)多肽抗氧化能力有最大值0.392 mmol/L，與最小值相差0.070 mmol/L，最終確定適宜的酶蟲(chóng)比為0.6%。

圖2 酶種類對(duì)蠐螬多肽抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of enzyme types on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva

圖3 酶蟲(chóng)比對(duì)蠐螬多肽提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme-worm ratio on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva

圖4 酶蟲(chóng)比對(duì)蠐螬多肽抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of enzyme-worm ratio on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva

2.3 底物濃度對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響

底物濃度對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 底物濃度對(duì)蠐螬多肽提取率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva

圖6 底物濃度對(duì)蠐螬多肽抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva

由圖5、圖6可知，其它條件不變，隨著底物濃度的增大，測(cè)得鮮蟲(chóng)多肽得率稍有增加，在底物濃度為5%時(shí)有最大值10.18%，底物濃度繼續(xù)升高，多肽得率下降，因?yàn)槿軇┹^少時(shí)，蛋白擴(kuò)散阻力較大，溶出率小，隨著溶劑用量的增加，蛋白更容易溶入溶劑中，提取率隨之增加，當(dāng)溶劑用量過(guò)大時(shí)，部分溶質(zhì)會(huì)殘留在水相中造成損失，而且不利于后續(xù)的減壓濃縮[16]；隨著底物濃度的增大，測(cè)得鮮蟲(chóng)多肽抗氧化能力增強(qiáng)，在底物濃度為5%時(shí)有最大值0.719 mmol/L，底物濃度繼續(xù)升高，多肽抗氧化能力減弱，最終確定適宜的底物濃度為5%。

2.4 水解體系pH值對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響

水解體系pH值對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。

由圖7、圖8可知，其它條件不變，水解體系pH值從4 到7 范圍內(nèi)，隨著水解體系pH值的升高，蠐螬多肽提取率及其抗氧化能力逐漸提高，在水解體系pH值為7 時(shí)，蠐螬多肽提取率及其抗氧化能力均達(dá)到最大值，分別為11.9%和0.434 mmol/L；當(dāng)水解體系pH值繼續(xù)升高，蠐螬多肽提取率及其抗氧化能力反而下降。原因是中性條件下，兩性的氨基酸呈陰離子狀態(tài)而有利于氨基反應(yīng)，而且在水解體系pH值為7 時(shí)，抗氧化能力最強(qiáng)，所以，選擇7 作為的適宜的水解體系pH值。

圖7 水解體系pH值對(duì)蠐螬多肽提取率的影響Fig.7 Effect of hydrolysis system pH on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva

圖8 水解體系pH值對(duì)蠐螬多肽抗氧化能力的影響Fig.8 Effect of hydrolysis system pH on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva

2.5 酶解時(shí)間對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響

酶解時(shí)間對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 酶解時(shí)間對(duì)蠐螬多肽提取率的影響Fig.9 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva

圖10 酶解時(shí)間對(duì)蠐螬抗氧化能力的影響Fig.10 Effect of enzymolysis time on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva

由圖9、圖10可知，其它條件不變，隨著酶解時(shí)間的增加，測(cè)得鮮蟲(chóng)多肽得率稍有升高，在酶解時(shí)間為3 h 時(shí)有最大值9.80%，酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，多肽得率稍有下降，在各處理之間差異性不顯著；隨著酶解時(shí)間的增加，測(cè)得蠐螬多肽抗氧化能力稍有增強(qiáng)，在酶解時(shí)間為3 h 時(shí)有最大值0.373 mmol/L，酶解時(shí)間繼續(xù)增加，多肽抗氧化能力減弱，原因是酶解產(chǎn)物會(huì)影響蛋白酶的催化反應(yīng)速率，產(chǎn)物在反應(yīng)初期的抑制能力較弱，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，游離的小肽和氨基酸越多，產(chǎn)物的抑制能力就越強(qiáng)[17]，導(dǎo)致3 h 后多肽提取率以及抗氧化能力值下降。

2.6 酶解溫度對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響

酶解溫度對(duì)蠐螬多肽提取率及其抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11、圖12。

圖11 酶解溫度對(duì)蠐螬多肽提取率的影響Fig.11 Effect of enzymatic temperature on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva

圖12 酶解溫度對(duì)蠐螬多肽抗氧化能力的影響Fig.12 Effect of enzymatic temperature on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva

由圖11、圖12可知，其它條件不變，隨著酶解溫度的升高，鮮蟲(chóng)多肽得率增加，在酶解溫度為45 ℃時(shí)有最大值11.94%，溫度繼續(xù)升高，多肽率下降；隨著酶解溫度的升高，測(cè)得鮮蟲(chóng)多肽抗氧化能力增強(qiáng)，在酶解溫度為45 ℃時(shí)有最大值0.625 mmol/L，酶解溫度繼續(xù)升高，多肽抗氧化能力減弱，原因是在45 ℃時(shí)，水解效果比較好，產(chǎn)生較多的相對(duì)分子量比較小具備高抗氧化活性的分子肽。因此，選擇45 ℃為酶解適宜溫度。

2.7 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響蠐螬多肽以及總抗氧化能力效果各因素中有意義的水平做正交試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳的提取條件。底物濃度（A）、水解體系pH值（B）、酶解溫度（C）對(duì)蠐螬多肽以及總抗氧化能力的影響較顯著，因此，采用L9（33）正交表，以底物濃度（A）、水解體系pH值（B）、酶解溫度（C）作為3 個(gè)考察因素，選取3 個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。正交因素水平表見(jiàn)表2，酶法提取多肽工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表3、表4。

表2 L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels for L9（33）orthogonal array design

表3 酶法提取多肽工藝L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 L9（33）orthogonal experiment design and results of enzymatic extraction of polypeptide

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

由表3和表4 的分析結(jié)果可以看出，RB＞RA＞RC，3個(gè)因素對(duì)蠐螬多肽提取率的影響順序?yàn)椋核怏w系pH值（B）＞底物濃度（A）＞酶解溫度（C）。3 個(gè)因素中，對(duì)蠐螬多肽提取率影響最大的因素是水解體系pH值。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到酶法提取蠐螬多肽的最佳條件為A2B2C1，即底物濃度5%、水解體系pH 7、酶解溫度40 ℃。

總抗氧化能力工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表5、表6。

表5 總抗氧化能力工藝L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 L9（33）orthogonal test design and results of total antioxidant capacity technology

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis

由表5和表6 的分析結(jié)果可以看出，RB＞RA＞RC，3 個(gè)因素對(duì)蠐螬多肽總抗氧化能力的影響順序?yàn)椋核怏w系pH值（B）＞底物濃度（A）＞酶解溫度（C）。以由直觀分析和方差分析得出，考察蠐螬多肽總抗氧化能力的最佳條件為A2B2C1，即底物濃度5 %、水解體系pH 7、酶解溫度40 ℃。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

按A2B2C1條件進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，蠐螬多肽提取率以及總抗氧化能力的平均值分別為14.21 %和0.752 mmol/L，高于表3、表5 中每一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，故A2B2C1為最佳提取工藝條件。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用酶解法提取蠐螬多肽，探索其多肽的抗氧化活性。首先選出了最佳脂肪酶，再通過(guò)5 個(gè)單因素：酶蟲(chóng)比、酶解溫度、酶解時(shí)間、底物濃度、水解體系pH值進(jìn)行考察，得出蠐螬多肽的提取工藝以及抗氧化能力條件為：酶蟲(chóng)比為0.6%，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為3 h，底物濃度為5%，水解體系pH值為7。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化蠐螬多肽提取率及其總抗氧化能力，獲得最佳酶解工藝，即底物濃度5%、水解體系pH 7、酶解溫度40 ℃。在此提取條件下，蠐螬多肽提取率14.21%，總抗氧化能力為0.752 mmol/L。由本研究可知，蠐螬酶解液具有天然的抗氧化能力，在抗氧化食品、飼料和藥品領(lǐng)域中據(jù)有一定的應(yīng)用前景。