刺參低聚肽對糖尿病小鼠降血糖作用的研究

王祖哲，馬普，左愛華，孫天利，彭聰，詹龍全，王軍琦，包衛(wèi)洋

（1.大連深藍肽科技研發(fā)有限公司，遼寧大連116000；2.揚州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州225000；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116000）

海參屬于棘皮動物門、海參綱、盾手目動物，是世界上少有的高蛋白、低脂肪、低糖、極低膽固醇的營養(yǎng)保健食品，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值?！妒澄锉静荨芬粫兄赋龊⒂兄餮a元氣，滋益五臟六腑和祛虛損的養(yǎng)生功能[1]。清代《本草從新》、《本草綱目拾遺》等中藥典籍將海參列為補益藥物，認為海參“性溫味甘咸，入心腎經(jīng)，具有生百脈血、補腎益精、壯陽療痿、滋陰利水等多種功能”[2]。

早在1989年，我國學(xué)者鐘志貴就提出以海參為主治療糖尿病的觀點[3]。王靜鳳等[4]研究發(fā)現(xiàn)日本刺參具有較好的降血糖作用，其作用機制與部分上調(diào)胰島素介導(dǎo)的PI3K/PKB/Glut4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。張昕、胡世偉等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，海地瓜和美國肉參中的幾種不同的多糖對以高脂高糖飼料飼喂法建立Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素抵抗程度有顯著改善作用。徐雷雷等[7]研究發(fā)現(xiàn)海參磷脂型二十碳五烯酸可明顯降低大鼠空腹血糖、糖化血清蛋白含量，明顯改善口服葡萄糖耐量、促進空腹血清胰島素的分泌。

由此可見，海參以及海參體內(nèi)多種活性成分對各種糖尿病模型動物（STZ 誘導(dǎo)糖尿病、自發(fā)性糖尿病、營養(yǎng)性糖尿?。┚忻黠@的降血糖作用，可用于糖尿病相關(guān)疾病的輔助治療。

海參蛋白是海參體內(nèi)含量最豐富的活性成分，可能是海參起到降糖作用的主要物質(zhì)，利用生物酶解技術(shù)將海參蛋白降解后可獲得海參低聚肽，已有研究表明海參低聚肽具有抗氧化、降血壓、抗疲勞、抗炎及增強免疫力等多種作用[8]。目前關(guān)于降糖作用研究較多的是各種來源的多糖，但也有研究表明不同來源的生物活性肽具有降血糖的作用，例如海洋膠原肽[9]、人參低聚肽[10]、西洋參多糖肽[11]、燕麥低聚肽[12]。王美華等[13]研究表明海參肽對小鼠血糖水平具有顯著的調(diào)節(jié)作用，董麗莎等[14]研究表明海參多肽可改善糖尿病大鼠的糖、脂代謝指標，對腎臟具有防護作用。王天星等[15]研究發(fā)現(xiàn)海參肽能夠有效改善Ⅱ型糖尿?。╠b/db）小鼠的血糖調(diào)節(jié)能力和口服糖耐量調(diào)節(jié)能力，還能有效抑制db/db 小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。這些研究結(jié)果均表明海參肽對糖尿病起到一定的治療、預(yù)防及緩解作用，但是只單獨研究了海參肽對糖尿病小鼠的某一方面作用，如降血糖、調(diào)血脂、抗炎，而且均未對海參肽降血糖作用的機理進行深入研究。

本實驗采用腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型，通過灌胃不同劑量的刺參低聚肽，研究刺參低聚肽對糖尿病小鼠的整體作用效果，對糖尿病小鼠的體重、空腹血糖、胸腺、脾臟、肝臟和腎臟的臟器系數(shù)，以及血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性進行綜合評價和分析，研究刺參低聚肽在降血糖、增強免疫力、保護肝腎及抗氧化方面的作用，為新型降血糖類產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺參低聚肽：大連深藍肽科技研發(fā)有限公司。具體生產(chǎn)過程為：取干燥、粉碎后的刺參，按料液比1 ∶10（g/mL）加入純水，在48 ℃，pH值8.5 條件下加入復(fù)合蛋白酶攪拌酶解4 h，滅酶，過膜分離、電滲析、膜濃縮及噴霧干燥得到分子量在1 000 Da 以下的刺參低聚肽粉。

超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒：南京建成生物工程研究所；鹽酸二甲雙胍：北京京豐制藥有限公司。

1.2 實驗動物

健康的昆明種小鼠70 只，體重（20±2）g，全部為雄性：大連醫(yī)科大學(xué)，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2013-0003，使用許可證號為SYXK（遼）2013-0006。

1.3 儀器與設(shè)備

GA-3 型血糖測試儀：三諾生物傳感股份有限公司；XS204SX 型電子秤：瑞士梅特勒-托利多公司；UV752 型分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；DK-S26 型恒溫水浴鍋：上海精宏公司；IECCL31R 型離心機：美國Thermo Scientific 公司。

1.4 方法

1.4.1 四氧嘧啶致糖尿病動物模型的建立與分組

依據(jù)《保健食品檢驗和評價技術(shù)規(guī)范》2003年版造糖尿病模型，并選取小鼠體重和空腹血糖值進行測定[16]，其他生物指標依據(jù)文獻進行選取和測定[17]。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機選取10 只作為正常對照組，60 只作為實驗組，實驗組禁食12 h 后按160 mg/kg 劑量一次腹腔注射四氧嘧啶致糖尿病，經(jīng)5 d 自由飲食后，禁食不禁水12 h，尾靜脈采血，用血糖測定儀測定空腹血糖濃度，血糖濃度≥10 mmol/L 為造模成功小鼠，確定為糖尿病模型，將符合標準的糖尿病模型小鼠隨機分為5 組作為實驗組。

灌胃劑量如下：正常對照組（NC）小鼠每天灌胃生理鹽水0.3 mL～0.4 mL/只；糖尿病模型對照組（MC）小鼠每天灌胃生理鹽水0.3 mL/只～0.4 mL/只；鹽酸二甲雙胍組（ME）小鼠每天灌胃鹽酸二甲雙胍0.2 g/kg；刺參低聚肽低劑量治療組（LG）、中劑量治療組（MG）和高劑量治療組（HG）小鼠每天分別灌胃刺參低聚肽0.1、0.2 g/kg 和0.5 g/kg。

1.4.2 小鼠體重測定

糖尿病模型建立成功后，各實驗組的小鼠分別在灌胃0、2、4、6 周后禁食12 h，測定小鼠體重。

1.4.3 小鼠血糖測定

糖尿病模型建立成功后，各實驗組的小鼠分別在灌胃0、2、4、6 周后禁食12 h，尾靜脈采血，用血糖儀測定各實驗小鼠的血糖值。

1.4.4 小鼠各生化指標測定

末次灌胃后眼球取血，離心取血清備用。眼球取血后斷頸處死，取其胸腺、脾臟、肝、腎稱重，并計算各臟器指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺平均重量（mg）/小鼠平均體重（g）；脾臟指數(shù)=脾臟平均重量（mg）/小鼠平均體重（g）；肝臟指數(shù)=肝臟平均重量（mg）/小鼠平均體重（g）；腎臟指數(shù)=腎臟平均重量（mg）/小鼠平均體重（g）。

小鼠SOD 活力、MDA 含量測定按試劑盒說明書測定并計算。

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本的t 檢驗進行差異顯著性檢驗，數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差（±s）表示[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化

各實驗組小鼠體重測定結(jié)果見表1。

由表1可知，經(jīng)連續(xù)6 周灌胃后，各實驗組小鼠體重均發(fā)生不同程度的變化，正常對照組的小鼠體重呈現(xiàn)穩(wěn)步增長，但糖尿病模型組小鼠體重在前2 周無明顯變化，體重增長現(xiàn)象被抑制，4 周后體重增長更加緩慢，與正常對照組相比已存在顯著差異（p<0.01），結(jié)果表明糖尿病模型組能明顯抑制小鼠體重的增長。

表1 各實驗組小鼠體重測定結(jié)果（±s，n=10）Table 1 The determination results of the body weight of experimental mice（±s，n=10）

表1 各實驗組小鼠體重測定結(jié)果（±s，n=10）Table 1 The determination results of the body weight of experimental mice（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，**p<0.01 極顯著性差異；與模型對照組比較，△p<0.05 顯著性差異，△△p<0.01 極顯著性差異。

組別 體重/g 0 周 2 周 4 周 6 周NC 20.68±1.83 24.03±1.06 34.86±4.71 39.53±3.48 MC 20.15±1.62 20.28±1.73 25.03±3.35** 27.24±2.79**ME 19.31±0.66 24.64±5.15 33.20±3.90△ 41.14±2.60△△LG 19.51±2.15 23.21±2.31 31.17±3.26 39.95±1.73△△MG 21.23±1.13 25.10±0.74 33.27±2.95△ 40.40±0.77△△HG 20.40±1.53 25.27±2.63 35.16±2.46△ 41.21±3.87△△

與糖尿病模型對照組相比，2 周后的刺參低聚肽各劑量組及鹽酸二甲雙胍組使得體重增長抑制現(xiàn)象得到控制，開始出現(xiàn)了緩慢增長，4 周后，刺參低聚肽中、高劑量組及鹽酸二甲雙胍治療組的小鼠體重明顯增加，與模型對照組相比存在顯著性差異（p<0.05），6周后刺參低聚肽各劑量組和鹽酸二甲雙胍組的小鼠體重顯著增加，呈現(xiàn)極顯著性差異（p<0.01）。結(jié)果充分表明了刺參低聚肽和鹽酸二甲雙胍可以改善糖尿病小鼠的消瘦狀態(tài)，起到增長體重的作用。

此外，正常小鼠生長及飲食、飲水情況正常，被毛光滑，而糖尿病模型小鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿及體重減輕的“三多一少”癥狀，被毛蓬松無光澤，采用不同劑量的刺參低聚肽對糖尿病小鼠進行灌胃后，以上癥狀得到相應(yīng)改善，表明刺參低聚肽對糖尿病小鼠的形態(tài)特征也具有一定的改善作用。

2.2 刺參低聚肽對小鼠血糖的影響

刺參低聚肽對糖尿病小鼠血糖的作用見表2。

表2 刺參低聚肽對糖尿病小鼠血糖的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Apostichopus japonicus oligo-peptides on blood glucose in diabetic mice（±s，n=10）

表2 刺參低聚肽對糖尿病小鼠血糖的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Apostichopus japonicus oligo-peptides on blood glucose in diabetic mice（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，**p<0.01 極顯著性差異；與模型對照組比較，△p<0.05 顯著性差異，△△p<0.01 極顯著差異。

組別 空腹血糖值/（mmol/L）0 周 2 周 4 周 6 周NC 5.10±1.04 5.20±0.70 5.60±0.66 5.00±1.31 MC 16.23±2.76** 16.50±2.15** 17.03±1.42** 16.70±1.23**ME 17.23±2.28** 15.80±1.45** 14.63±0.71**△ 13.97±1.86**△LG 16.67±2.92** 15.60±1.15** 15.53±0.55** 14.43±0.70**△MG 17.07±1.65** 14.93±1.55** 14.50±1.1**△ 14.10±0.85**△HG 16.63±1.34** 15.30±2.75** 14.43±1.51**△ 13.90±2.31**△

由表2可知，與正常對照組小鼠相比，建模后各組小鼠血糖濃度明顯升高，存在極顯著性差異（p＜0.01），且整個實驗期間，糖尿病模型對照組的血糖濃度一直處于高位，表明糖尿病的模型建造穩(wěn)定，可用于實驗研究。

灌胃2 周后，與糖尿病模型對照組相比，刺參低聚肽各劑量組與鹽酸二甲雙胍治療組的血糖均有小幅度下降，但不存在顯著性差異（p＞0.05）。灌胃4 周后，雖然刺參低聚肽低劑量組與糖尿病模型對照組相比差異不顯著（p＞0.05），但是，刺參低聚肽中、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組的血糖均顯著低于糖尿病模型對照組，呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），灌胃6 周后，刺參低聚肽各劑量組及鹽酸二甲雙胍組的血糖均顯著低于糖尿病模型對照組，呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），刺參低聚肽和鹽酸二甲雙胍組均起到明顯降低血糖的作用。刺參低聚肽低劑量組在6 周后起到明顯降血糖的效果，而中、高劑量在4 周就存在明顯降血糖的效果，表明刺參低聚肽的作用效果與灌胃濃度和時間存在正相關(guān)性。但是與正常對照組相比，各實驗組的血糖值仍舊明顯高于正常對照組。

2.3 刺參低聚肽對小鼠臟器指數(shù)的影響

刺參低聚肽對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的作用見表3。

表3 刺參低聚肽對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of Apostichopus japonicus oligo-peptides on organ index in diabetic mice（±s，n=10）

表3 刺參低聚肽對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of Apostichopus japonicus oligo-peptides on organ index in diabetic mice（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*p＜0.05 顯著性差異；與模型對照組比較，△p＜0.05 顯著性差異。

組別 胸腺指數(shù)/(mg/g) 脾臟指數(shù)/(mg/g) 肝臟指數(shù)/(mg/g) 腎臟指數(shù)/(mg/g)NC 1.56±0.49 4.23±0.12 42.90±2.58 15.09±1.88 MC 0.69±0.27* 2.88±0.67* 34.48±4.82* 13.80±0.67*ME 1.06±0.58 4.26±0.63△ 41.99±2.72△ 14.43±0.80 LG 1.08±0.37 3.28±0.37 40.67±3.07△ 14.22±1.02 MG 1.32±0.50 3.72±0.84 41.93±2.88△ 14.52±0.75 HG 1.60±0.50△ 4.27±0.83△ 42.33±2.69△ 15.72±1.50△

從表3中可以看出，與正常對照組相比，糖尿病模型對照組小鼠各臟器指數(shù)均明顯下降（p＜0.05），通過進一步解剖發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的各臟器發(fā)生粘連（見圖1），表明糖尿病可顯著抑制小鼠臟器發(fā)育，對小鼠各個臟器損害嚴重。

圖1 刺參低聚肽對糖尿病小鼠各臟器的影響Fig.1 The effect of Apostichopus japonicus oligo-peptides on organ in diabetic mice

刺參低聚肽各劑量組和鹽酸二甲雙胍組均不同程度的提高糖尿病小鼠的各臟器指數(shù)，與糖尿病模型對照組相比，鹽酸二甲雙胍組的脾臟指數(shù)與肝臟指數(shù)存在顯著升高（p＜0.05），刺參低聚肽低、中劑量組的肝臟指數(shù)顯著升高（p＜0.05），刺參低聚肽高劑量組的胸腺、脾臟、肝臟及腎臟指數(shù)均有顯著升高（p＜0.05），而且從圖1可以看出刺參低聚肽高劑量組的各臟器表面光滑、無粘連，表明刺參低聚肽的高劑量組能顯著改善糖尿病對各臟器的損傷，提升各臟器指數(shù)，且效果要好于鹽酸二甲雙胍組。

2.4 刺參低聚肽對小鼠抗氧化能力的影響

刺參低聚肽對小鼠血清SOD 及MDA 含量的影響見表4。

表4 刺參低聚肽對小鼠血清SOD 及MDA 含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of Apostichopus japonicus oligo-peptides on MDA contents，SOD activity in serum of diabetic mice（±s，n=10）

表4 刺參低聚肽對小鼠血清SOD 及MDA 含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of Apostichopus japonicus oligo-peptides on MDA contents，SOD activity in serum of diabetic mice（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*p＜0.05 顯著性差異，**p＜0.01 極顯著性差異；與模型對照組比較，△p＜0.05 顯著性差異，△△p＜0.01 極顯著性差異。

組別 MDA/(nmol/mL) SOD/（U/mL）NC 10.97±0.85 205.84±5.30 MC 15.50±2.29* 188.03±12.81**ME 11.13±1.80△ 206.90±4.24△LG 13.50±2.64 202.72±8.75 MG 12.20±2.48 210.29±5.33△HG 10.98±2.25△ 225.01±14.30△△

從表4可以看出，與正常對照組相比，糖尿病模型對照組的MDA 含量明顯升高，SOD 含量明顯降低，表明糖尿病明顯降低小鼠的抗氧化能力，且呈現(xiàn)極顯著差異（p＜0.01）。

與糖尿病模型對照組相比，刺參低聚肽低、中、高劑量組MDA 含量分別降低12.90%、21.29%、29.16%，且高劑量呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），SOD 含量分別升高7.81%、11.84%、19.67%，中劑量呈現(xiàn)出顯著性差異（p＜0.05），高劑量呈現(xiàn)極其顯著性差異（p＜0.01）。結(jié)果表明，刺參低聚肽可以降低糖尿病小鼠血清中MDA含量，提高SOD 的活性，增強小鼠的抗氧化能力，從而促進機體內(nèi)自由基的清除，其中，刺參低聚肽高劑量組對糖尿病小鼠機體的抗氧化效果最佳，已經(jīng)達到正常對照組的水平。

3 結(jié)論與討論

糖尿病是以高血糖為特征的終身性代謝性疾病，目前已成為人類最常見的慢性病之一，且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，給人們的健康帶來了極大的威脅，嚴重影響生活質(zhì)量。目前常用控制血糖的治療藥物為磺胺類、雙胍類及α-糖苷酶抑制劑等西藥，其特點是作用強、見效快，可有效控制血糖濃度。但這些西藥的缺點是存在不同程度的毒副作用，如鹽酸二甲雙胍對胃的刺激、疲倦、頭暈等，不能從根本阻止胰島細胞的進一步壞死，往往導(dǎo)致胰島素依賴，而且無法從根本上改變糖尿病患者的疾病狀態(tài)，需要終身服用藥物。因此，人們致力于開發(fā)和研究高效低毒的天然降糖藥物，尤其是從天然資源中找到療效即好又無毒副作用的降糖藥，以期從根本上進行治療。

目前刺參低聚肽已廣泛應(yīng)用于各種功能性食品中，較高的營養(yǎng)價值和功效性使其受到廣大消費者的喜愛，為了更好的開發(fā)可用于糖尿病病人的功能性食品，有必要對刺參低聚肽的降血糖效果、起效劑量及其作用機制進行深入研究。

多飲、多尿、多食和體重減輕的“三多一少”癥狀及高血糖是糖尿病患者最直觀的表現(xiàn)，海參低聚肽對糖尿病小鼠不僅具有顯著的降糖作用，還能增加糖尿病小鼠體重，緩解“三多一少”的癥狀，對糖尿病小鼠的高血糖及低體重等癥狀具有明顯的改善和治療作用。

胸腺和脾臟是機體的免疫器官，胸腺和脾臟指數(shù)是衡量胸腺和脾臟功能正常與否的一項重要指標。肝臟和腎臟是機體的解毒及排泄器官，糖尿病患者會出現(xiàn)不同程度的肝腎損傷，嚴重的可引起死亡，所以說糖尿病本身并不可怕，可怕的是糖尿病的并發(fā)癥，95%以上患者是糖尿病并發(fā)癥引起的死亡，而機體免疫功能損害及臟器損傷是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一[19]。刺參低聚肽高劑量組不僅明顯提升糖尿病小鼠的胸腺、脾臟、肝臟、腎臟指數(shù)（p＜0.05），使其接近正常對照組的水平，而且使糖尿病所致粘連的臟器變的光滑、無粘連，表明刺參低聚肽對小鼠胸腺、脾臟及肝腎均具有明顯的保護作用，能夠提高小鼠免疫能力及排毒代謝的能力，從而有助于延緩及避免糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)。

SOD 是重要的抗氧化酶，能夠清除和分解自由基，其活性可以較全面地反映機體的抗氧化能力，MDA 是一種脂質(zhì)過氧化物，可以反映機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度。當機體遭受自由基攻擊而被氧化時，抗氧化劑的使用使抗氧化酶類活性得到提高，如血清中SOD等酶活性明顯提高，MDA 含量明顯下降，從而使機體的抗氧化能力得到增強。氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，清除自由基已被認為是治療及改善糖尿病及其并發(fā)癥的重要途徑[20]。

四氧嘧啶作為一種β 細胞毒劑，其產(chǎn)生的自由基可選擇性破壞胰島β 細胞，降低體內(nèi)胰島素水平，使血糖明顯升高，從而引起試驗性糖尿病，刺參低聚肽使得抗氧化酶SOD 活性增高，過氧化產(chǎn)物MDA 含量顯著降低，起到明顯抗氧化的作用，能夠提高糖尿病小鼠的抗氧化能力，從而清除體內(nèi)過多的自由基，從而改善四氧嘧啶所致的糖尿病，同時機體抗氧化能力的增強也會對糖尿病的高血糖及其腎病、血管病變等并發(fā)癥具有積極的改善作用。

綜上所述，刺參低聚肽對四氧嘧啶致糖尿病小鼠有積極的治療作用，不僅能改善糖尿病小鼠的低體重、高血糖的癥狀，還能明顯保護各個臟器，增強機體的免疫力、排毒代謝能力和抗氧化作用，從根本上對糖尿病起到改善及治療作用，達到標本兼治的效果，推測刺參低聚肽可能通過提高機體的抗氧化作用和免疫力起到降低血糖和防治、延緩糖尿病并發(fā)癥的作用。雖然實驗中刺參低聚肽的效果不如鹽酸二甲雙胍治療效果顯著，但可以通過長期服用起到穩(wěn)步降血糖及改善機體損傷的作用，能夠從根本上解決糖尿病患者對西藥降糖藥物的依賴性。在實驗所設(shè)的3 個劑量中，中劑量組（0.2 g/kg）作用4 周后可起到顯著的降糖效果，高劑量組（0.5 g/kg）效果最佳，可用于糖尿病相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。