羅漢菜籽總黃酮的提取、純化與體外抗氧化活性研究

朱明明，高天怡，徐志珍，周佳祺，李俊雯，陳玨，張文清，*

（1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海200237；2.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海201800）

羅漢菜（Thlaspi arvense Linn）為雙子葉植物綱十字花科菥蓂屬一年生草本植物，學(xué)名菥蓂，別名遏藍(lán)菜、蘇敗醬、敗醬草、苦芥子、野榆樹、大芥、瓜子草和菥目等[1]，在我國各地都有分布，其菜籽可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰痛、急性結(jié)膜炎和胃痛等癥狀[2]。

黃酮（flavonoids）是一類具有1，3-二苯基丙烷或1，2-二苯基丙烷結(jié)構(gòu)的含氧雜環(huán)天然有機(jī)化合物。隨著近年來研究的不斷完善與深入，黃酮在抗菌、抗腫瘤和抗氧化等方面表現(xiàn)出了顯著活性[3-8]，引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

國內(nèi)涉及到羅漢菜籽化學(xué)成分研究的報道較少，并且多以黑芥子苷和多糖為主[9-11]。因此，探究羅漢菜籽總黃酮的提取純化及其體外抗氧化活性研究，對于綜合開發(fā)利用羅漢菜這一寶貴植物資源具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅漢菜籽采摘自上海嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：阿拉丁試劑公司；1，1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：麥克林試劑公司；2-2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2′-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）：阿達(dá)瑪斯試劑公司；抗壞血酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-201 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；DKS24 電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵：上海予華儀器有限公司；WKZ-4 粉碎機(jī)：青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司；FD1 冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器制造有限公司；CH-8606 微量分析天平：瑞士Mettler Toledo 公司；UV-2550 紫外可見分光光度計：日本Shimadu 公司；Flash A 中壓制備色譜系統(tǒng)：蘇州匯通色譜分離純化有限公司；Poroshell 120 EC-C18 色譜柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Agilent 1100 高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；SinoChrom ODS-BP 制備色譜柱（10 μm）：依利特有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羅漢菜籽原料預(yù)處理

羅漢菜籽去除雜質(zhì)，浮選去除品質(zhì)較差的種籽，干燥后粉碎并過40 目篩；用石油醚（沸程為30 ℃～60 ℃）浸泡過夜，去除菜籽中的油脂，然后將羅漢菜籽烘干備用。

1.3.2 羅漢菜籽總黃酮提取工藝優(yōu)化

稱量5.0 g 預(yù)處理過后的羅漢菜籽，放置于圓底燒瓶中，安裝好回流提取裝置。根據(jù)陳飛等[12]探究的單因素試驗條件，并做出改進(jìn)，按照一定條件（乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)）提取羅漢菜籽中的總黃酮，對應(yīng)的正交試驗因素水平表和正交試驗表如表1和表2，回流結(jié)束后將提取液濃縮，并定容于10 mL容量瓶中，進(jìn)行含量測定。

表1 總黃酮提取正交試驗因素水平表Table 1 Parameters of orthogonal experiment on extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

表2 總黃酮提取正交試驗表Table 2 Orthogonal experiments on extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

1.3.3 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用紫外分光光度法和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定并計算總黃酮含量[13]。用移液槍移取0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 于6 只25 mL 比色管中，加70%乙醇至總體積為5.0 mL，加1.0 mL 5%的亞硝酸鈉，搖勻并放置6 min，加1.0 mL 10%硝酸鋁，搖勻并放置6 min，加10.0 mL 4%氫氧化鈉，加蒸餾水至刻度并搖勻，放置15 min。以蘆丁試劑空白作為參比液，在510 nm 波長處測定吸光度，以蘆丁濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 黃酮含量測定

用移液槍移取1.0 mL 粗提液于25 mL 比色管中，按照1.3.3 的方法測定黃酮含量。

1.3.5 制備色譜純化羅漢菜籽總黃酮

采用Flash A 中壓制備色譜系統(tǒng)，色譜柱為SinoChrom ODS-BP 10 μm。稱取2.0 g 黃酮粗提物，用50 mL 30%甲醇水溶解，高速離心機(jī)在1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心10 min，離心結(jié)束后取上清液上樣。系統(tǒng)中設(shè)定洗脫溶劑為0.1%乙酸水（A）∶甲醇（B）=70 ∶30（體積比），流速為10 mL/min，收集目標(biāo)組分，收集完畢后更換洗脫溶劑為純甲醇并清洗色譜柱，將收集到的組分濃縮后冷干，即得到純化后的羅漢菜籽總黃酮。

1.3.6 羅漢菜籽總黃酮對DPPH 自由基清除能力測定

配制不同濃度的樣品溶液，取1.0 mL 并加入1.0 mL 40 μg/mL 的DPPH 甲醇溶液，充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm 波長處測定吸光度，以未加入樣品的DPPH 甲醇溶液作為空白參比，以BHT 為陽性對照，清除率的計算公式如下：

式中：A0為空白對照的吸光度；A為樣品溶液的吸光度。

1.3.7 羅漢菜籽總黃酮對ABTS+自由基清除能力測定

配制7 mmol/L 的ABTS+二銨鹽水溶液和4.9 mmol/L的過硫酸鉀水溶液，等體積混合并在暗處反應(yīng)16 h，即得ABTS+工作液。配制不同濃度的樣品溶液，取1.0 mL樣品溶液，然后加入2.0 mL ABTS+工作液，劇烈震蕩后在暗處常溫靜置10 min，以無水甲醇為參比液，BHT的甲醇溶液為陽性對照，在734 nm 波長處測定吸光度，清除率計算公式見公式（1）。

1.3.8 羅漢菜籽總黃酮鐵還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測定

配制pH值為3.5 的醋酸鹽緩沖溶液，10 mmol/L的TPTZ 溶液和20 mmol/L 的FeCl3溶液，以10 ∶1 ∶1的體積比均勻混合上述3 種溶液即得FRAP 工作液。配制不同濃度的FeSO4溶液，各取100 μL 并用FRAP工作液定容至5.0 mL，37 ℃水浴加熱20 min，在539 nm波長處測定吸光度，建立FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一定濃度的樣品溶液，用FRAP 工作液定容至5.0 mL，37 ℃水浴加熱20 min，以抗壞血酸的水溶液作為陽性對照，在539 nm 波長處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢菜籽總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度計，及A（lNO）33-NaNO2-NaOH 顯色法對羅漢菜籽提取液中總黃酮含量進(jìn)行測定。圖1 是蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性回歸方程為Y=0.013 7X-0.001 9（其中Y為吸光度；X為蘆丁濃度，μg/mL），R2=0.999 4，n=5。該圖說明在蘆丁濃度為3.2 μg/mL～16.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.1.2 羅漢菜籽總黃酮提取工藝優(yōu)化

有機(jī)溶劑萃取法提取羅漢菜籽黃酮黃酮正交試驗結(jié)果見表3。采用正交試驗法探究羅漢菜籽總黃酮的最優(yōu)提取工藝，由表3的極差分析結(jié)果可知，各因素對羅漢菜籽總黃酮含量的影響程度各不相同，主次順序為A＞D＞B＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響最大，其次是提取次數(shù)，而提取時間影響最小。從該表中可知最優(yōu)提取條件為乙醇體積濃度60 %，料液比1 ∶30（g/mL），提取時間75 min，提取次數(shù)3 次，測得的總黃酮含量為7.75 mg/g。但從提高生產(chǎn)效率的角度考慮，確定最終的提取條件為乙醇濃度為60%，料液比1 ∶30（g/mL），提取時間75 min，提取次數(shù)2 次。

表3 有機(jī)溶劑萃取法提取羅漢菜籽黃酮黃酮正交試驗結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal experiment on organic solvent extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

因此在該最終條件下進(jìn)行3 次重復(fù)性試驗，結(jié)果見表4。

表4 有機(jī)溶劑萃取法提取羅漢菜籽黃酮重復(fù)性試驗Table 4 Results on the repeatability verification experiment of the extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

由表4可知，3 次重復(fù)試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為1.94%，重復(fù)性良好，且總黃酮含量較高。

2.2 制備色譜純化羅漢菜籽總黃酮

通過Flash A 中壓制備色譜系統(tǒng)，得到純化后的總黃酮，樣品外觀為淡黃色不定型粉末。采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 顯色法對純化后的總黃酮進(jìn)行含量測定，測得黃酮含量為563.8 mg/g。純化前后總黃酮成分的高效液相色譜圖見圖2。

圖2 羅漢菜籽總黃酮純化前后的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of flavonoids from Thlapsi Arvense Linn seeds before and after purification by preparative chromatography

由圖2可以看出純化后的總黃酮在5 min～9 min范圍內(nèi)雜峰幾乎消失，表明純化效果良好。

2.3 羅漢菜籽總黃酮體外抗氧化活性研究

2.3.1 對DPPH 自由基清除能力測定

BHT、總黃酮粗提物和總黃酮純化物對DPPH 自由基的清除效果見圖3～圖5，以半數(shù)抑制濃度（IC50）為評價標(biāo)準(zhǔn)，IC50越小，說明對DPPH 自由基的清除效果越好。BHT、總黃酮純化物和粗提物對DPPH 自由基的清除率可達(dá)70%，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為10.25、18.50 μg/mL 和103.00 μg/mL。

圖3 BHT 對DPPH 自由基的清除效果Fig.3 Scavenging activity of BHT on DPPH free radicals

圖4 純化后總黃酮對DPPH 自由基的清除效果Fig.4 Scavenging activity of purified flavonoids on DPPH free radicals

圖5 總黃酮粗提物對DPPH 自由基的清除效果Fig.5 Scavenging activity of crude flavonoids on DPPH free radicals

由圖3～圖5可知在相同時間和DPPH 自由基總數(shù)下，BHT 的清除效果最好，粗提物的清除效果最差，但經(jīng)制備色譜純化后的總黃酮可顯著提升對DPPH 自由基的清除效果。

2.3.2 對ABTS+自由基清除能力測定

BHT、總黃酮粗提物和總黃酮純化物對ABTS+自由基的清除效果見圖6～圖8。

圖6 BHT 對ABTS+自由基的清除效果Fig.6 Scavenging activity of BHT on ABTS+free radicals

圖7 純化后總黃酮對ABTS+自由基的清除效果Fig.7 Scavenging activity of purified flavonoids on ABTS+free radicals

圖8 總黃酮粗提物對ABTS+自由基的清除效果Fig.8 Scavenging activity of crude flavonoids on ABTS+free radicals

由結(jié)果可知，BHT、黃酮純化物和粗提物，對ABTS+自由基的清除率都達(dá)到了75 %以上，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為7、41、80 μg/mL。由圖可知BHT 對ABTS+自由基的清除速度更快，并且效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于黃酮純化物和粗提物。然而，對黃酮粗提物進(jìn)行純化，可以顯著提升其對ABTS+自由基的清除效果。

2.3.3 鐵還原能力（FRAP）的測定

建立了濃度范圍為0～120 mmol/L 的FeSO4濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖9。

圖9 FRAP 試驗標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of the FRAP experiment

Fe2+-TPTZ 的濃度與吸光度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.021 4X+0.151 9，R2=0.999 5，n=11。在相同的測試條件下，將反應(yīng)后的抗壞血酸對照溶液、總黃酮粗提物和純化后樣品溶液的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到FeSO4的當(dāng)量濃度，即樣品的抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度值所需的FeSO4濃度（微摩爾數(shù)），其濃度越大，則抗氧化活性越強(qiáng)。經(jīng)計算得知，抗壞血酸樣液為1 424.82 μmol/（L·mg），黃酮純化物為169.10 μmol/（L·mg），黃酮粗提物為54.09 μmol/（L·mg）?？箟难岬目寡趸钚赃h(yuǎn)高于純化黃酮和黃酮粗提物，但是純化后的黃酮抗氧化活性顯著升高。

3 結(jié)論

目前對羅漢菜籽的研究報道多數(shù)側(cè)重于黑芥子甙，少有對黃酮的分離純化研究。本文采用正交試驗法優(yōu)化了總黃酮提取工藝，最終確定提取條件為：乙醇濃度為60%，料液比1 ∶30（g/mL），提取時間75 min，提取次數(shù)2 次。采用制備色譜對粗提物中的總黃酮進(jìn)行純化，色譜條件為：上樣量約10 mL，流動相為0.1%乙酸水：甲醇（體積比）=70 ∶30，流速為10 mL/min。在該條件下，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 顯色法對制備色譜純化后的黃酮含量進(jìn)行測定，黃酮含量由10.0 mg/g提升至563.8 mg/g。

本文還對總黃酮粗提物和純化產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性測定，包括對DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力的測定，以及對鐵還原能力的測定，醇體系以BHT作為對照，水體系以抗壞血酸作為對照。結(jié)果表明，將黃酮進(jìn)行純化，其抗氧化活性顯著提升，但是無論是純化黃酮還是黃酮粗提物，抗氧化效果都略遜于BHT 和抗壞血酸。