敲除Ras1基因?qū)α阎辰湍干L(zhǎng)及產(chǎn)孢影響

譚秀梅 丁 祥 袁榮美 侯怡鈴

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009）

Ras1基因有很多功能，能直接激活參與細(xì)胞極性調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀的建立或維持的SCD1。此外，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)Ras1基因還能夠參與Cdc42蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠提高蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞核的概率。

在裂殖酵母中，Ras1基因的缺失會(huì)降低交配率。但鮮少有人研究?jī)HRas1基因的缺失對(duì)裂殖酵母產(chǎn)孢及生長(zhǎng)的影響，該實(shí)驗(yàn)采用基因敲除技術(shù)，敲除Ras1基因，探究Ras1基因的缺失對(duì)裂殖酵母的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響，為科學(xué)的判定其敲除基因的功能和合理開發(fā)裂殖酵母資源提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 材料

供試菌株及野生型菌株（表1）現(xiàn)保存在西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-80 ℃的冰箱中。

1.1.2 酵母生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基及藥品試劑

裂殖酵母完全培養(yǎng)液YES、完全固體培養(yǎng)基、裂殖酵母產(chǎn)孢培養(yǎng)基 E mm-N參照王文超[5]的方法配制。藥品試劑：PBS緩沖液、纖維素酶（購(gòu)于阿拉丁公司）。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別在25 ℃、37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀每隔2 h測(cè)一次培養(yǎng)液OD595值，連續(xù)測(cè)12 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD595值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.2 裂殖酵母產(chǎn)孢及孢子形態(tài)觀察

將野生型 PT286與 PT287交配作為對(duì)照組，3201菌株的h+與 h-交配作為實(shí)驗(yàn)組，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后制片，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)20個(gè)產(chǎn)孢酵母的孢子數(shù)，截取典型孢子形態(tài)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖酵母在25 ℃下生長(zhǎng)分析

在25 ℃恒溫培養(yǎng)下，生長(zhǎng)曲線圖如圖1所示。從圖1可以看出，在0～6 h，野生型 PT286生長(zhǎng)要略快于3201菌株；在8 h， 兩菌OD595值相同為0.34；8 h以后，PT286的生長(zhǎng)持續(xù)加速且未見衰退趨勢(shì)，而3201菌株的生長(zhǎng)逐漸趨于平緩；在12 h，PT286的OD595值為0.62，大于3201的0.48。說(shuō)明敲除基因 Ras1會(huì)使裂殖酵母的生長(zhǎng)變慢。

圖1 裂殖酵母在25 ℃下的生長(zhǎng)曲線圖

2.2 裂殖酵母在37 ℃下生長(zhǎng)分析

在37 ℃恒溫培養(yǎng)下，生長(zhǎng)曲線圖如圖2所示。從圖2可以看出，在0～6 h，野生型 PT286生長(zhǎng)速度要快于3201菌株，但差距不大；6 h以后，PT286迅速生長(zhǎng)明顯快于3201菌株；在12 h，PT286的OD595值達(dá)到0.84，而3201的OD595值為0.45，與25 ℃的幾乎一致，說(shuō)明突變株對(duì)溫度不敏感。在25 ℃及37 ℃恒溫條件下，敲除基因Ras1都會(huì)使其生長(zhǎng)變慢，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.3 裂殖酵母孢子數(shù)分析

我們分別統(tǒng)計(jì)20個(gè)裂殖酵母所產(chǎn)生的孢子，結(jié)果如圖3所示，野生型裂殖酵母100 %產(chǎn)生4個(gè)孢子；3201菌株有75 %裂殖酵母產(chǎn)生1個(gè)孢子，25 %裂殖酵母產(chǎn)生2個(gè)孢子 。說(shuō)明敲除基因Ras1會(huì)影響裂殖酵母孢子量。

圖2 裂殖酵母在37 ℃下的生長(zhǎng)曲線圖

圖3 裂殖酵母孢子數(shù)

2.4 裂殖酵母酵母孢子形態(tài)圖分析

孢子形態(tài)圖如圖4所示，結(jié)果表明，野生型裂殖酵母產(chǎn)生4個(gè)孢子，其形態(tài)如圖4（a）所示，3201菌株產(chǎn)生1～2個(gè)孢子，其形態(tài)如圖4（b）、圖4（c）所示，在相同觀察倍數(shù)下，野生型的孢子略大于3201菌株產(chǎn)生的孢子，說(shuō)明敲除基因 Ras1會(huì)影響裂殖酵母孢子形態(tài)。

圖4 裂殖酵母孢子形態(tài)圖（100×10）

3 結(jié)論

野生型裂殖酵母在敲除基因 Ras1后，無(wú)論是在25 ℃還是37 ℃的恒溫條件下連續(xù)培養(yǎng)12 h，3201菌株生長(zhǎng)速度都要比野生型裂殖酵母緩慢，即敲除基因Ras1后會(huì)影響裂殖酵母的生長(zhǎng)。敲除基因 Ras1后其產(chǎn)孢數(shù)目由原來(lái)的100 %產(chǎn)4個(gè)孢子到75 %產(chǎn)生1個(gè)孢子、25 %產(chǎn)生2個(gè)孢子，且孢子略小于野生型，即敲除這個(gè)基因會(huì)影響裂殖酵母產(chǎn)孢。綜上所述，敲除Ras1會(huì)影響裂殖酵母的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，但相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。