一株煙葉內(nèi)源菌的鑒定及其在煙草提取物中的應(yīng)用

衛(wèi) 青，崔洪亮，曹 環(huán)，劉 鶴，馬 林

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司，云南昆明 650106)

隨著煙草行業(yè)提出要加快培育以“高香氣、高品質(zhì)、低焦油、低危害”為主導(dǎo)的品牌體系，造紙法再造煙葉的應(yīng)用更加廣泛[1]。在卷煙配方中添加再造煙葉能夠有效降低焦油[2-3]、苯酚[4]、NNK、NNN、NAB、NAT[5]等有害成分。然而，由于生產(chǎn)再造煙葉的主要原料是煙梗和碎煙，使其香氣淡薄、刺激和雜氣較重[6]，嚴(yán)重影響卷煙的感官品質(zhì)，最終導(dǎo)致再造煙葉在卷煙中摻配比例很難達(dá)到10%以上。

煙葉經(jīng)收獲調(diào)制后，其表面存在大量微生物，且這些微生物貫穿煙葉發(fā)酵的始終[7]。特別是其中一些微生物能夠直接或間接產(chǎn)生生物酶，可以將煙草原料中的多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分解、轉(zhuǎn)換成還原糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)之間可以發(fā)生類似美拉德反應(yīng)，從而促進(jìn)致香成分的生成，提升感官品質(zhì)[8]。利用微生物技術(shù)提高煙葉品質(zhì)方面的研究已有較多報(bào)道[9-11]，然而這些研究大多集中在利用細(xì)菌[12-13]及酵母菌[14]等提高煙葉品質(zhì)方面。直接利用真菌菌劑應(yīng)用于造紙法再造煙葉煙膏，提高再造煙葉抽吸品質(zhì)的研究還鮮少報(bào)道。筆者對(duì)一株煙草內(nèi)源真菌進(jìn)行鑒定，并利用該菌株菌劑處理再造煙葉煙膏，旨在探討真菌菌劑提高再造煙葉煙膏品質(zhì)的可行性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。2012年從紅大煙葉中篩選獲得一株產(chǎn)蛋白酶及多糖酶的真菌RSCT26，菌種現(xiàn)保存于云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司菌種庫(kù)。

1.1.2培養(yǎng)基。菌種RSCT26活化和發(fā)酵所用培養(yǎng)基均為自制煙膏培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基為煙膏(云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司提供)100 mL，水900 mL，自然pH；固體培養(yǎng)基為煙膏100 mL，水900 mL，瓊脂15 g，自然pH。

1.1.3儀器。OLYMPUS-BX51光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；ABS204-S電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)FW-400A高速粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；SKY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器(昆明納瑞科技有限公司)；Eppendorf核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf公司)；4N/7620401005紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)；KRK高濃盤磨(日本Kumagai Riki Kogyo公司)；AT-7890A/5975C Agilent GC-MS聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.2方法

1.2.1RSCT26形態(tài)學(xué)鑒定。將菌株RSCT26活化，然后接種到裝入10 mL固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，7 d后觀察菌落形態(tài)并測(cè)量菌落直徑，并使用OLYMPUS-BX51光學(xué)顯微鏡觀察孢子形態(tài)，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[15]和《真菌的形態(tài)和分類》[16]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2RSCT26分子鑒定。DNA提取采用CTAB法[17]，然后使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取DNA的濃度與純度。真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)PCR擴(kuò)增引物采用ITS1-F與ITS4[11]，引物ITS1-F序列為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS4序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，ITS1-F 1 μL，ITS4 1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，DNA模板(50～100 ng/μL)1 μL，ddH2O 39.75 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序工作由北京華大基因生物有限公司完成。

將所獲得的序列在NCBI網(wǎng)站(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站進(jìn)行在線Blast序列比對(duì)，選擇同源性高的序列作為參比對(duì)象，使用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用臨位相接法(Neighbor-joining)，應(yīng)用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3RSCT26蛋白酶及多糖酶活的測(cè)定。RSCT26菌株活化，接入裝有300 mL煙膏液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，28 ℃、160 r/min發(fā)酵96 h，每8 h取樣1次，10 000 r/min離心30 min，上清液過(guò)濾即得RSCT26菌劑，做3個(gè)平行樣，按照GB/T 23527—2009方法測(cè)定RSCT26菌劑多糖酶及蛋白酶酶活。

1.2.4RSCT26菌劑在再造煙葉煙膏中的應(yīng)用。按照?qǐng)D1再造煙葉生產(chǎn)工藝，取“1.2.3”制得的RSCT26菌劑，按5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加到混合提取液中，40 ℃下處理60 min，滅活，濃縮獲得煙膏，涂布，切絲，制樣，對(duì)照樣為等比例添加滅活菌劑，其他試驗(yàn)步驟與試驗(yàn)樣品一致。

圖1 RSCT26菌劑處理工藝流程Fig.1 The process flow of RSCT26 preparation

1.2.5化學(xué)常規(guī)成分及致香成分的測(cè)定。按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法YC/T 159—2002、YC/T 160—2002、YC/T 161—2002、YC/T 162—2002、YC/T 217/2007、YC/T 166—2003測(cè)定煙膏中可溶性總糖、還原糖、總植物堿、總氮、氯、鉀及蛋白質(zhì)含量。致香成分的檢測(cè)采用GC-MS聯(lián)用儀法[18-19]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用Excel 2010軟件和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

1.2.6感官評(píng)價(jià)。取“1.2.4”中所得樣品手工打煙，恒溫恒濕[(22±1)℃、(60±2)%]平衡48 h，組織云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司的專家組按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T498—2014對(duì)再造煙葉樣品進(jìn)行感官品質(zhì)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株RSCT26的形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)分離純化的菌株RSCT26進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)RSCT26菌落呈圓形，黑褐色，培養(yǎng)7 d直徑約5.5 cm。在OLYMPUS-BX51光學(xué)顯微鏡下制片拍照，如圖2所示，菌絲有橫隔，孢子梗從菌絲生出，直或彎曲，單生，分隔，分枝，分生孢子呈倒梨形、倒棒狀或近橢圓形，具有3～5個(gè)橫隔，具有縱、斜隔，分隔處略有縊縮，孢子大小約15.0 μm×6.0 μm。經(jīng)初步鑒定，確定其為鏈格孢屬真菌。

圖2 菌株RSCT26的孢子形態(tài)Fig.2 Spore morphology of RSCT26 strain

2.2菌株RSCT26分子鑒定將菌株RSCT26的ITS區(qū)序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的ITS區(qū)序列進(jìn)行同源性比較，選取同源性在95%以上的9株真菌，以PyrenochaetopsispoaeKJ869117為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。由圖3可知，菌株RSCT26與已報(bào)道的鏈格孢屬真菌(Alternariaalternata)親源關(guān)系最近，且有99%以上的相似性。這也表明菌株RSCT26在分類學(xué)地位上歸屬于鏈格孢屬，結(jié)合“2.1”中形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株RSCT26鑒定為鏈格孢屬真菌(Alternariaalternata)。

圖3 菌株RSCT26的ITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of RSCT26 based on ITS region

2.3多糖酶及蛋白酶酶活菌株RSCT26發(fā)酵96 h，每8 h取樣并檢測(cè)多糖酶及蛋白酶酶活，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，2種酶酶活不斷升高。多糖酶酶活在64 h時(shí)達(dá)到最大值(482.12 U/mL)，保持12 h左右，然后開(kāi)始降低；蛋白酶在72 h基本達(dá)到峰值(47.89 U/mL)，直到96 h基本變化不大；2種酶在發(fā)酵72 h時(shí)基本都處于酶活峰值，因此在后續(xù)試驗(yàn)中選取該時(shí)間點(diǎn)來(lái)獲取菌劑。

圖4 菌株RSCT26的蛋白酶和多糖酶酶活Fig.4 The protease and polysaccharidase activities of RSCT26 strain

2.4RSCT26菌劑處理后煙膏化學(xué)常規(guī)成分及致香成分的變化RSCT26菌劑處理后煙膏化學(xué)成分變化如表1所示。由表1可知，與對(duì)照樣相比，RSCT26菌劑處理后幾種主要有機(jī)質(zhì)成分含量發(fā)生了顯著變化，煙膏中可溶性總糖和還原糖含量顯著增加，蛋白質(zhì)和總氮含量降低，RSCT26菌劑多糖酶酶活較高，多糖酶將煙膏中的多糖分解為還原糖和二氧化碳，蛋白酶分解蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸，而且這些還原糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成致香物質(zhì)[20]，二氧化碳揮發(fā)進(jìn)入空氣，最終表現(xiàn)為可溶性總糖和還原糖含量增加，蛋白質(zhì)和總氮含量有一定幅度降低；其他化學(xué)成分(如鉀離子、總植物堿、氯離子)變化不大。鄭勤安[21]利用2種菌及1種蛋白酶混合配制成的煙草發(fā)酵增質(zhì)劑處理煙草原料萃取濃縮液，可溶性總糖和還原糖含量增加，蛋白質(zhì)含量降低，煙草品質(zhì)得到很大提升，此結(jié)果與該研究結(jié)果相一致。

煙草中糖類和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物雜環(huán)類化合物是煙草香味的主要來(lái)源之一，能夠增加堅(jiān)果香、烘烤香、焦糖香等香味[21]。通過(guò)GC-MS對(duì)煙膏致香成分的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。RSCT26菌劑處理后煙膏中雜環(huán)類化合物增幅最大，達(dá)到64.930%。有機(jī)酸類物質(zhì)也是煙草中一類重要的香味成分，等級(jí)越高、品質(zhì)越好的煙葉有機(jī)酸含量越高[22]，而且在煙草發(fā)酵過(guò)程中微生物分解果膠和木質(zhì)素等大分子化合物也可以產(chǎn)生有機(jī)酸[21]。RSCT26菌劑處理后煙膏中糠酸和棕櫚酸含量均大幅度增加，有機(jī)酸類物質(zhì)總量增加53.530%。RSCT26菌劑處理后煙膏中一些重要致香成分(如二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、二氫大馬酮等)均有一定程度增加。此外，RSCT26菌劑處理后煙膏中酮類化合物、醇類化合物和醛類化合物含量均有不同程度增加，而致香成分總量增加21.559%，表明RSCT26菌劑處理有利于增加煙膏中致香成分總量，從而提高煙膏的品質(zhì)。

表1 RSCT26菌劑處理后煙膏化學(xué)常規(guī)成分的檢測(cè)結(jié)果

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

Note：Different lowercase letters in the same column indicated significant differences(P<0.05)；Different capital letters in the same column indicated significant differences(P<0.01)

表2 RSCT26菌劑處理后煙膏致香成分檢測(cè)結(jié)果

接下表

2.5感官評(píng)價(jià)對(duì)RSCT26菌劑處理與未處理的煙膏進(jìn)行再造煙葉中應(yīng)用，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果表明RSCT26菌劑處理后，與對(duì)照樣品相比再造煙葉產(chǎn)品香氣質(zhì)較好、香氣量較足，刺激和雜氣方面都有所改善，但在香氣豐富性上依然有所欠缺。

3 結(jié)論

通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)相結(jié)合的手段，將菌株RSCT26鑒定為鏈格孢屬(Alternariaalternata)，該菌株發(fā)酵72 h多糖酶及蛋白酶酶活達(dá)到峰值，用該菌株菌劑處理再造煙葉煙膏，與對(duì)照相比，處理后煙膏可溶性總糖和還原糖含量顯著增加，總氮和蛋白質(zhì)含量顯著降低，幾大類主要致香成分含量均顯著增加。感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，RSCT26菌劑處理后再造煙葉香氣質(zhì)變好，香氣量變足，刺激和雜氣變小。大量研究表明，鏈格孢屬真菌大多為煙葉致病菌，將該菌株應(yīng)用于生產(chǎn)時(shí)還需對(duì)其安全性進(jìn)行進(jìn)一步應(yīng)用評(píng)價(jià)。