新疆釀酒葡萄表皮醋酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸條件優(yōu)化

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(1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

新疆地大物博，氣候獨特，瓜果品種多、種植面積大、糖度極高、品質(zhì)優(yōu)良，但由于加工和銷路的問題，每年產(chǎn)生大量的廢渣和殘次果，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。果醋是一種以果蔬或其下腳料為主要原料，通過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵而成的具有多種營養(yǎng)成分和保健功能的液態(tài)食品[1,2]。因此，發(fā)展新疆特色果醋能夠快速、有效地解決新疆果品加工廢渣及殘次果經(jīng)濟損失的問題。

醋酸菌種是決定果醋產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素之一。目前，果醋釀造的優(yōu)良菌株分為醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡糖桿菌屬(Gluconobacter)2個屬。常用的釀造用醋酸菌還有奧爾蘭醋桿菌(A.orleanense)、許氏醋桿菌(A.schuegenbachii)、產(chǎn)醋醋酸桿菌(A.acetigenum)、彎曲醋桿菌(A.curvum)、紋膜醋桿菌(A.aceti)、惡臭醋酸桿菌(A.rancens)、攀膜醋桿菌(A.ascendans)、膠膜醋桿菌(A.xylinum)等[3,4]。本文以新疆釀酒葡萄為原料，篩選高產(chǎn)酸醋酸菌，為新疆特色果醋業(yè)的發(fā)展以及果蔬加工產(chǎn)業(yè)鏈的延伸奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣

從新疆石河子142團采集10例赤霞珠釀酒葡萄。

1.1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂粉、蛋白胨、氫氧化鈉、丙三醇、酵母膏、DNA Marker和ddH2O：購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；碳酸鈣、無水乙醇、Easy Taq Supermix：購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；Gold View、DNA Kit：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，以上試劑均為分析純。

5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf儀器公司；TC-512PCR擴增儀 英國Techne公司；Power Pac Universal電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國BioRad公司；CX21FS1光學(xué)顯微鏡 Olympus 公司；LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GNP-9272智能生化培養(yǎng)箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖(1%)、酵母膏(1%)、碳酸鈣(2%)、無水乙醇(3%)、自然pH，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至60 ℃以下再加入無水乙醇[5]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(GYPE)：葡萄糖(0.1%)、蛋白胨(0.2%)、酵母膏(0.5%)、無水乙醇(6%)、121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至60 ℃以下再加入無水乙醇[6]。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取20 g葡萄樣品，在無菌條件下，將其加入到裝有50 mL無菌水的三角瓶中，并放置三角瓶于搖床中，在30 ℃、120 r/min條件下，培養(yǎng)12 h，得菌懸液。

1.2.2 菌株的分離純化

采用梯度稀釋平板涂布法對葡萄樣品進(jìn)行分離，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h。經(jīng)連續(xù)劃線培養(yǎng)2～3次后，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[7]，與張紀(jì)中的《微生物分類學(xué)》進(jìn)行比對。根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色進(jìn)行初步分類鑒定，革蘭氏染色，將革蘭氏染色陰性菌(顯微鏡下為紅色)純培養(yǎng)物經(jīng)液體培養(yǎng)基富集之后按600 μL甘油和水混合液(1∶1)，將400 μL液體培養(yǎng)物移入1.5 mL離心管中，保藏5份至-20 ℃冰箱中，并做好標(biāo)記。

1.2.3 醋酸菌的16S rDNA分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌體DNA的提?。涸囼濪NA的提取采用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒，根據(jù)試劑盒提供藥品和說明書步驟進(jìn)行DNA的提取。

PCR擴增[8]：

上游引物：27F-5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；

下游引物：1492R-5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。

擴增體系：總體積為50 μL，其中包括2 μL的模板DNA，2 μL的上游引物，2 μL的下游引物，25 μL的Easy Taq Supermix，19 μL的ddH2O，并做空白對照。

擴增程序[9]：94 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)為94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，然后再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測[10]，并置于-20 ℃保藏以備后續(xù)試驗所用。

將符合標(biāo)準(zhǔn)的16S rDNA擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)BLAST中進(jìn)行同源序列比對，根據(jù)比對的結(jié)果，下載相似性在99%以上菌種的16S rDNA序列，連同測序菌株的序列用Claustal X1.83軟件進(jìn)行多序列比對，結(jié)果采用MEGA 6.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行1000次置信度分析[11]。

1.2.4 總酸的測定

取-20 ℃下保存的菌種在液體培養(yǎng)基中活化，加入5%的活化菌液于50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于搖床于30 ℃，170 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，待測總酸。

24 h測1次樣品相關(guān)的數(shù)據(jù)，對樣品搖勻后在無菌操作臺中進(jìn)行，并且用空白培養(yǎng)基作為空白對照，用堿式滴定法測量菌種產(chǎn)酸量，用移液槍吸取2 mL至三角瓶中進(jìn)行滴定，然后用下式計算出總酸[12]：

產(chǎn)酸量(g/L)=V/V0×CNaOH×60/L。

式中：V為發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH的體積數(shù)，mL；V0為以空白培養(yǎng)基為對照滴定耗用的NaOH的體積數(shù)，mL；CNaOH為NaOH溶液的濃度，mol/L；L為樣品的體積數(shù)，mL；60為醋酸的分子量。

1.2.5 高產(chǎn)酸菌株的篩選

接種5%的液體培養(yǎng)物于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行7天發(fā)酵實驗，每天測其總酸，比較產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸能力，篩選出產(chǎn)酸最高的菌株。

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗[13]

1.2.6.1 不同濃度無水乙醇對高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力的影響

活化產(chǎn)酸最高的菌株，按照5%的接種量分別接種于2%，4%，6%，8%，10%乙醇的GYPE培養(yǎng)基中，將其置于30 ℃搖床中發(fā)酵24 h，每組3個平行，并做空白對照。

1.2.6.2 不同濃度葡萄糖對高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力的影響

活化產(chǎn)酸最高的菌株，按照5%的接種量分別接種于0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%葡萄糖的GYPE培養(yǎng)基中，將其置于30 ℃搖床中發(fā)酵24 h，每組3個平行，并做空白對照。

1.2.6.3 不同濃度酵母膏對高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力的影響

活化產(chǎn)酸最高的菌株，按照5%的接種量分別接種于0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%酵母膏的GYPE培養(yǎng)基中，將其置于30 ℃搖床中發(fā)酵24 h，每組3個平行，并做空白對照。

1.2.7 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，先對微生物生長有重要影響的碳源和氮源，即葡萄糖、酵母膏、無水乙醇的用量，按照L9(33)正交表進(jìn)行正交試驗設(shè)計[14]，各因素水平見表1。

表1 產(chǎn)酸條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Optimization of orthogonal test factors and levels of acid-producing conditions %

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單因素分析，用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行正交分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的分離

通過初步分離純化，共篩選得到15株醋酸菌，通過菌落形態(tài)和革蘭氏染色顯微形態(tài)比較，將篩選出的醋酸菌初步分為5類，菌落形態(tài)特征與顯微形態(tài)特征見表2和圖1。

表2 培養(yǎng)基上醋酸菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of lactic acid bacteria on culture medium

圖1 醋酸菌革蘭氏染色圖Fig.1 Gram staining of acetic acid bacteria

2.2 16S rDNA擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

選取每種表型中生長活性最好的菌株作為代表菌株，分別標(biāo)號為K-1、K-2、K-3、K-4、K-5并提取其DNA。將提取的5株醋酸菌的DNA進(jìn)行PCR擴增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1500 bp左右出現(xiàn)了特異性擴增條帶，且條帶較為明亮，PCR擴增結(jié)果符合測序標(biāo)準(zhǔn)。電泳檢測結(jié)果見圖2。

圖2 16S rDNA擴增產(chǎn)物電泳檢測圖Fig.2 The electrophoresis detection map of 16S rDNA amplification products

2.3 醋酸菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 醋酸菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16S rDNA phylogenetic tree of lactic acid bacteria

由圖3可知，K-1、K-2、K-3與AcetobacterperoxydansJMC 25077同源性強，屬于Acetobacterperoxydans(過氧化醋桿菌)，K-4與AcetobacteroeniLMG 21952同源性強，屬于Acetobacteroeni(葡萄酒醋酸桿菌)，K-5與GluconobacteralbidusNBRC 3250同源性強，屬于Gluconobacteralbidus(白葡糖桿菌)。

2.4 高產(chǎn)酸醋酸菌種的篩選

圖4 不同菌株產(chǎn)酸量的比較Fig.4 Comparison of acid production of different strains

由圖4可知，在發(fā)酵至第5天時不同菌株的產(chǎn)酸量都呈快速上升趨勢；發(fā)酵5天之后，產(chǎn)酸量呈緩慢上升趨勢；當(dāng)發(fā)酵至第7 天時，K-4菌株的產(chǎn)酸量最高，達(dá)到了4.2 g/dL。因此，選取K-4菌株作為后期產(chǎn)酸條件優(yōu)化的供試菌株。

2.5 產(chǎn)酸條件的優(yōu)化

2.5.1 不同濃度無水乙醇對K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響

圖5 不同濃度無水乙醇對K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.5 Effect of different concentration of absolute ethanol on acid-producing ability of K-4 strain

由圖5可知，K-4菌株的乙醇濃度不同，產(chǎn)酸量變化明顯，隨著濃度的升高，產(chǎn)酸量升高，6%以后逐漸下降?？芍?%時產(chǎn)酸量最高，酒精是醋酸菌生長代謝能量的提供者，酒精濃度越高，對醋酸菌生長有抑制作用，所以培養(yǎng)基配制時最佳乙醇濃度為6%。

2.5.2 不同濃度葡萄糖對K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響

圖6 不同濃度葡萄糖對K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.6 Effect of different concentration of glucose on acid-producing ability of K-4 strain

由圖6可知，K-4菌株葡萄糖濃度在2%時產(chǎn)酸量最高，大于2%時產(chǎn)酸量逐漸降低。隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)菌繁殖能力增強。但是當(dāng)葡萄糖添加量增加到2.5%時，細(xì)菌繁殖能力下降，菌液濃度下降，所以在培養(yǎng)基配制時葡萄糖最佳添加量為2%。

2.5.3 不同濃度酵母膏對K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響

圖7 不同濃度酵母膏對K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.7 Effect of different concentration of yeast extract on acid-producing ability of K-4 strain

由圖7可知，K-4菌株酵母膏濃度在1.5%時最佳，在1.5%之前，隨著酵母膏濃度的升高，產(chǎn)酸量增大，但隨著酵母膏濃度的升高，細(xì)菌產(chǎn)酸能力下降。所以，醋酸菌產(chǎn)酸量在1.5%時高于其他濃度，為最佳濃度。

2.6 K-4菌株產(chǎn)酸正交試驗

K-4菌株產(chǎn)酸正交試驗結(jié)果與分析見表3。

表3 產(chǎn)酸條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Optimization of orthogonal test results and analysis of acid-producing conditions

由正交表極差分析可知，對K-4菌株產(chǎn)酸影響的重要性為B>C>A，即葡萄糖濃度>無水乙醇濃度>酵母膏濃度。由正交試驗結(jié)果可知，K-4菌株最佳產(chǎn)酸條件為A2B1C2，即酵母膏1.5%，葡萄糖1.5%，無水乙醇6%。

3 結(jié)論

通過對新疆釀酒葡萄赤霞珠表皮的醋酸菌進(jìn)行不斷篩選和純化，最終初步得到了15株醋酸菌，經(jīng)過對其鏡檢以及形態(tài)特征的對比，初步將其分成了5種類型，挑取5株活性較好的代表菌株進(jìn)行DNA提取和16S rDNA序列擴增測序，NCBI序列比對結(jié)果表明：K-1、K-2、K-3屬于Acetobacterperoxydans(過氧化醋桿菌)，K-4屬于Acetobacteroeni(葡萄酒醋酸桿菌)，K-5屬于Gluconobacteralbidus(白葡糖桿菌)。

通過對K-1、K-2、K-3、K-4、K-5進(jìn)行7天發(fā)酵試驗，結(jié)果表明K-4產(chǎn)酸能力最高，由正交表極差分析得出，對K-4菌株產(chǎn)酸影響的重要性為：B>C>A，即葡萄糖濃度>無水乙醇濃度>酵母膏濃度。所以，由正交試驗結(jié)果可知，K-4菌株最佳產(chǎn)酸條件為A2B1C2，即酵母膏1.5%，葡萄糖1.5%，無水乙醇6%。