成年火龍果植株莖段愈傷組織誘導、增殖及分化研究

鄧仁菊，范建新，王永清，劉 濤，金吉芬

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 亞熱帶作物研究所，貴州 貴陽 550006；3. 四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130；4. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 果樹科學研究所，貴州 貴陽 550006；5. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 品種資源研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】火龍果，屬仙人掌科三角柱屬植物，原產(chǎn)于南美、北美及中美州熱帶地區(qū)，是集觀賞、食用、保健等于一身的名優(yōu)水果。目前主要生產(chǎn)國有越南、哥倫比亞、墨西哥、哥斯達尼加、尼加拉瓜、中國等，澳大利亞、以色列、美國有少量種植?；瘕埞筇锷a(chǎn)主要采用15～20 cm莖段扦插繁殖或直接采用50 cm以上大苗定植[1-2]，然而長期采用該方法容易導致體內(nèi)感染多種病毒并不斷累積，致其品種逐漸退化，嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)；另外，扦插繁殖或大苗定植需要原材料較多，繁殖速度相對較慢，自然變異率較低，對新品種的創(chuàng)制培育也相當不利。而植物組織培養(yǎng)作為一種高效的繁殖方法，可以在相對較小的空間和相對較短的時間，利用非常有限的資源獲得大量健康的再生苗，且組織培養(yǎng)還能通過與生物技術等手段相結(jié)合進行新種質(zhì)的培育和創(chuàng)制?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)外已有關于火龍果莖段快速增殖、愈傷組織誘導等方面的報道[3-11]。但絕大數(shù)有關這方面的研究都是通過種子萌發(fā)幼苗、莖段等直接誘導成苗[3, 4, 6, 12-13]或進行植株再生培養(yǎng)研究[14]，這樣得到的無菌苗可能因種子基因型不同而存在較大差異?！颈狙芯壳腥朦c】迄今，通過火龍果成熟莖段進行愈傷組織誘導、增殖及分化的相關報道較少。因此，筆者等以火龍果成年植株的莖段為試材，通過改進和優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立相對完善的火龍果再生體系?！緮M解決的關鍵問題】為火龍果今后的生物技術育種及遺傳轉(zhuǎn)化研究提供參考和奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

防止外植體污染及褐化的研究以貴州主栽火龍果品種紫紅龍、晶紅龍和粉紅龍成年植株的枝條為試材；愈傷組織的誘導、增殖及分化研究以火龍果品種紫紅龍成年植株的枝條為試材。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 防止外植體污染及褐化研究 ①不同表面滅菌時間。采取紫紅龍成年植株新萌發(fā)的幼嫩莖段和1年生成熟莖段，用少量洗潔精水將其表面臟物洗凈后，流水沖洗1 h。于超凈工作臺上用75 %的酒精和0.1 %的升汞分別處理不同時間。幼嫩莖段酒精消毒時間設3個水平(10、20和30 s)，升汞滅菌時間設4個水平(4、6、8和10 s)；成熟莖段酒精消毒時間設定為30 s，升汞滅菌時間設7個水平(4、6、8、10、12、15和18 s)。消毒滅菌完成后，用無菌水沖洗5次，將外植體表面水分吸干，切成1cm×1 cm 左右的莖段，接種在相同的培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L上，每處理接種180個外植體，30 d統(tǒng)計污染率、褐化率及成活率。②外植體不同成熟度的影響。取成年植株上不同成熟度(新梢0～5 cm、新梢5～10 cm、新梢10～20 cm和1年生成熟莖段)的火龍果莖段，用少量洗潔精水將其表面臟物洗凈，流水沖洗1 h后，均采用75 %乙醇30 s+0.1 %升汞8min消毒，無菌水沖洗5次。外植體切割方法、接種培養(yǎng)基、統(tǒng)計方法均同本節(jié)1)。③外植體不同基因型的影響。以不同基因型的紫紅龍、晶紅龍和粉紅龍成年植株上新萌發(fā)的幼嫩莖段和1年生成熟莖段為試材，用少量洗潔精水將其表面臟物洗凈后，流水沖洗1h后。幼嫩莖段采用75 %乙醇30 s+0.1 %升汞6 min消毒，無菌水沖洗5次；成熟莖段采用75 %乙醇30 s+0.1 %升汞12 min消毒，無菌水沖洗5次。外植體切割方法、接種培養(yǎng)基、統(tǒng)計方法均同本節(jié)①。④ 不同取樣時間。以紫紅龍、晶紅龍和粉紅龍成年植株上新萌發(fā)的幼嫩莖段為試材，分別于3月15日、5月4日、7月9日、10月13日和12月10日取樣。幼嫩莖段的消毒方式同本節(jié)3)，外植體切割方法、接種培養(yǎng)基、統(tǒng)計方法同本節(jié)①。

1.2.2 愈傷組織的誘導、增殖及分化研究 (1)愈傷組織的誘導：①不同成熟度及取材部位對愈傷組織誘導的影響。取‘紫紅龍’當年新萌發(fā)的長15～20 cm幼嫩枝條和1年生成熟枝條，分別按頂部、中部、基部切割成約1 cm×1 cm左右莖段，接種在MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L的培養(yǎng)基上，每個取材部位接種60～120個外植體，觀察并記錄愈傷組織的誘導情況及愈傷組織的質(zhì)量，30 d統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。②不同生長調(diào)節(jié)劑濃度及配比對愈傷組織誘導的影響。以‘紫紅龍’當年新萌發(fā)的長10～20 cm幼嫩莖段為試材，取中間部位將其切割成約1 cm×1 cm左右莖段，接種在MS附加不同濃度的6-BA (0.1、0.2和0.4 mg/L)和2, 4-D (0.25、0.5和1.0 mg/L)，以及不同濃度的TDZ (0.2、0.4和0.8 mg/L)和KT (0.2、0.4和0.8 mg/L)的培養(yǎng)基上，完全組合設計，共18個處理，每處理接種60～120個外植體，觀察并記錄愈傷組織的誘導情況及愈傷組織的質(zhì)量，30 d統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。③不同生長調(diào)節(jié)劑濃度及配比對愈傷組織誘導的影響。以‘紫紅龍’當年新萌發(fā)的長10～20 cm幼嫩莖段為試材，取中間部位將其切割成約1 cm×1 cm左右莖段，接種在MS附加不同濃度的6-BA (0.1、0.2和0.4 mg/L)和2, 4-D (0.25、0.5和1.0 mg/L)，以及不同濃度的TDZ (0.2、0.4和0.8 mg/L)和KT (0.2、0.4和0.8 mg/L)的培養(yǎng)基上，完全組合設計，共18個處理，每處理接種60～120個外植體，觀察并記錄愈傷組織的誘導情況及愈傷組織的質(zhì)量，30 d統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。④不同基本培養(yǎng)基濃度對愈傷組織誘導的影響。以‘紫紅龍’當年新萌發(fā)的長10～20 cm幼嫩枝條為試材，取其中間部位切割成約1 cm×1 cm左右莖段，接種在不同MS濃度 (MS、1/2MS、1/4MS和1/8MS)附加TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L的培養(yǎng)基上，試驗共計4個處理，每處理接種60～120個外植體，觀察并記錄愈傷組織的誘導情況及愈傷組織的質(zhì)量，30 d統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。⑤糖類及濃度對愈傷組織誘導的影響。以‘紫紅龍’當年新萌發(fā)的長10～20 cm幼嫩枝條為試材，取其中間部位切割成約1 cm×1 cm左右莖段，接種在以MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的蔗糖(15、30、45和60 g/L)和葡萄糖(15、30、45和60 g/L)。試驗共8個處理，每處理接種60～120個外植體，觀察并記錄愈傷組織的誘導情況及愈傷組織的質(zhì)量，30 d統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。⑥不同培養(yǎng)條件對愈傷組織誘導的影響。以‘紫紅龍’當年新萌發(fā)的長10～20 cm幼嫩枝條為試材，取中間部位將其切割成約1 cm×1 cm左右莖段，接種在MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L的培養(yǎng)基上，分別置于黑暗條件下培養(yǎng)7、15和30 d及完全光照培養(yǎng)，共4個處理，每處理接種60～120個外植體，觀察并記錄愈傷組織的誘導情況及愈傷組織的質(zhì)量，30 d統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。

(2)愈傷組織的繼代與增殖。將初代培養(yǎng)誘導出來的愈傷組織切割成約0.5 cm×0.5 cm大小，接種到含不同生長調(diào)節(jié)劑的增殖培養(yǎng)基中，設12個處理，每處理接種60塊愈傷組織，30 d后轉(zhuǎn)接1次。觀察并記錄愈傷組織的生長狀態(tài)，60 d統(tǒng)計愈傷組織增殖系數(shù)。

(3)愈傷組織的分化。愈傷組織增殖2～3次后，將其切割成直徑約1 cm的小塊，分別轉(zhuǎn)入含不同生長調(diào)節(jié)劑的芽苗分化培養(yǎng)基，試驗釆用四因素四水平正交試驗設計，因素及水平：TDZ(0.2、0.4、0.8和1.2 mg/L)、2, 4-D(0.5、1.0、1.5和2.0 mg/L)、NAA(0.1、0.2、0.4和0.6 mg/L)及椰子水(0、10 %、20 %和30 %)，共16個處理。每處理接種60塊愈傷組織。60 d后統(tǒng)計愈傷組織分化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

褐化率(%)=(發(fā)生褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100；污染率(%)=(發(fā)生污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100； 成活率(%)=(成活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100；愈傷組織誘導率(%)=(出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100；愈傷組織增殖系數(shù)=統(tǒng)計時愈傷組織的重量/接種時愈傷組織的重量；愈傷組織分化率(%)=(分化的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù))×100。

所有數(shù)據(jù)均采用DPSv7.05進行統(tǒng)計分析，LSD法檢驗不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 防止外植體污染及褐化的研究

2.1.1 不同表面滅菌時間對外植體污染及褐化的影響 從表1看出，不同成熟度的枝條采用不同表面滅菌時間處理后，外植體在污染率、褐化率及成活率方面均表現(xiàn)出較大差異。不同處理中莖段的褐化率隨消毒時間的延長而增加，而污染率則隨消毒時間的增加而降低。同一處理下，成熟莖段的褐化率顯著低于幼嫩莖段，而污染率則相反。適宜火龍果當年生幼嫩莖段的表面滅菌方式為75 %酒精消毒30 s+0.1 %HgCl2消毒6～8 min。適宜火龍果1年生成熟莖段的表面滅菌方式為75 %酒精消毒30 s+0.1 %HgCl2消毒12～15 min。

2.1.2 不同成熟度取樣對火龍果外植體污染及褐化的影響 從表2可知，相同滅菌條件下，1年生火龍果成熟莖段的污染率顯著高于新萌發(fā)的幼嫩莖段，而褐化率則剛好相反。在幼嫩莖段中，褐化率以0～5 cm新梢最高，5～10 cm次之，10～20 cm最低；3種取樣類型的污染率之間無顯著差異。

表1 不同表面滅菌時間火龍果莖段的污染、褐化及成活情況

續(xù)表1 Continued table 1

外植體Explant滅菌時間Sterilizing time75 %酒精 (s)0.1 %HgCl2 (min)污染率(%)Rate of contamination褐化率(%)Rate of browning成活率(%)Rate of survival3067.9d4.2d87.9a3085.4e8.1c86.5a30103.2f12.7b84.1b10～20 cm幼嫩枝條Young stem with 10-20 cm length30447.8a0.052.2e30640.1b0.059.9d30831.7c0.068.3c301022.9d0.077.1bc301215.3e0.084.7a301512.6f3.8b83.6a30189.5g10.7a79.8b

注：同列不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in tha same column indicate significance of difference atP<0.05 level. The same as below.

2.1.3 不同基因型對外植體污染及褐化的影響 從表3看出，無論是幼嫩莖段還是成熟莖段，污染率均以紫紅龍最高，其成活率最低；晶紅龍和粉紅龍間的污染率、褐化率及成活率差異均不明顯。

2.1.4 不同取樣時間對外植體褐化及污染的影響 從表4看出，外植體的污染及褐化受取樣時間的影響較大。同等條件下，春季取樣的外植體，其污染率極顯著低于夏、秋、冬季；冬季取樣的外植體，其污染率雖較秋季顯著降低但仍明顯高于春季；秋冬兩季取樣的外植體褐化率相對較高?？傮w而言，春季取材的外植體組培污染率相對較小，褐化率相對較低，進而有較高的成活率。

2.2 莖段愈傷組織的誘導

2.2.1 不同成熟度及取材部位對愈傷組織誘導的影響 從表5看出，紫紅龍成熟莖段的不同部位愈傷組織的誘導率均較低，邊緣周圍產(chǎn)生少量愈傷組織，生長緩慢，在培養(yǎng)過程中易褐化死亡，說明成熟莖段不適宜作為誘導愈傷組織的外植體；采用當年萌發(fā)的新梢(長10～20 cm)作外植體出愈率較高，且以莖段中部誘導效果最好，產(chǎn)生的愈傷組織多，質(zhì)量較好。

表2 不同成熟度取樣火龍果外植體的污染、褐化及成活情況

表3 不同基因型火龍果外植體的褐化、污染及成活情況

表4 不同取樣時間火龍果外植體污染、褐化及成活情況

表5 莖段不同成熟度及取材部位的愈傷組織誘導情況

2.2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑及配比對愈傷組織誘導的影響 從表6看出，兩兩不同生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度配比對火龍果莖段愈傷組織的誘導存在較大差異。當2, 4-D濃度一定時，以1.0 mg/L的6-BA愈傷誘導率最高；當6-BA濃度一定時，愈傷組織的誘導率則隨2, 4-D濃度的增加而增加。另外，當TDZ濃度一定時，愈傷組織的誘導率隨KT濃度的增加有所增加。當KT濃度一定時，愈傷組織的誘導率隨TDZ濃度的增加呈先增加后降低趨勢。總體而言，莖段愈傷組織的誘導率生長調(diào)節(jié)劑TDZ+KT組合明顯高于6-BA+2, 4-D組合。當TDZ濃度為0.4 mg/L，KT濃度為0.8 mg/L時，外植體的愈傷誘導率最高，為81.1 %；愈傷組織為黃綠色、致密狀，外表有顆粒狀突起。

2.2.3 不同基本培養(yǎng)基濃度對愈傷組織誘導的影響 從表7看出，在生長調(diào)節(jié)劑相同的情況下，4種不同的培養(yǎng)基濃度對愈傷誘導的影響差異明顯，以MS培養(yǎng)基愈傷誘導率最高，愈傷組織質(zhì)量較好，呈淡綠色，致密、顆粒狀，長勢較好。

2.2.4 糖類及濃度對愈傷組織誘導的影響 從表8看出，同種糖類不同濃度誘導愈傷組織差異明顯，誘導率隨糖濃度的增加呈先升高后降低趨勢。同一濃度下，添加葡萄糖的培養(yǎng)基較添加蔗糖的培養(yǎng)基能誘導出更多的愈傷組織。從表中還可以看出，無論是蔗糖還是葡萄糖，當其濃度在45 g/L及以上時，愈傷組織的誘導率呈下降趨勢；而當濃度為30 g/L時，愈傷組織的誘導率最高，愈傷組織的質(zhì)量也較好。

表6 不同生長調(diào)節(jié)劑濃度及配比下莖段愈傷組織的誘導情況

續(xù)表6 Continued table 6

生長調(diào)節(jié)劑濃度(mg/L) Concentration of different growth regulators2, 4-D6-BATDZKT接種數(shù)(個)Inoculated number誘導愈傷組織數(shù)(個)Number of inducted calli誘導率(%)Induction rate愈傷組織質(zhì)量Callus quality0.20.500904752.2def淡綠色,致密,少0.21.000905257.8cde黃白色,致密0.40.2500904954.4cde淡綠色,致密0.40.500904550.0def黃綠色,疏松0.41.000905662.2bcd黃綠色,致密,顆粒狀000.20.2904752.2cde淡綠色,疏松000.20.4905561.1bcd黃綠色,致密000.20.8905358.9cde黃白色,疏松,顆粒狀000.40.2905763.3bcd黃綠色,疏松000.40.4906572.2b黃綠色,致密,顆粒狀000.40.8907381.1a黃綠色,致密,顆粒狀000.80.2905257.8cde黃白色,致密000.80.4905864.4bc黃白色,疏松000.80.8906167.8bc黃綠色,疏松,顆粒狀

2.2.5 培養(yǎng)條件對愈傷組織誘導的影響 從表9看出，不同處理下莖段出愈的時間和誘導率均存在較大差異。整個過程完全采用光照培養(yǎng)，出愈的時間最早，愈傷誘導率為75.6 %；暗培養(yǎng)時間越長，出愈時間越推遲，愈傷誘導率也越低。綜合比較，經(jīng)7 d暗培養(yǎng)再轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)的外植體，其愈傷組織誘導率最高，形態(tài)、質(zhì)地也較好。

表7 不同基本培養(yǎng)基濃度下火龍果愈傷組織的誘導情況

表8 糖類及濃度對莖段愈傷組織的誘導情況

表9 不同培養(yǎng)條件下莖段愈傷組織的誘導情況

2.3 愈傷組織的增殖

從表10看出，TDZ 濃度不變的情況下，在MS培養(yǎng)中分別添加 0.8 mg/L KT或 0.8 mg/L ZT，其愈傷組織增殖系數(shù)都較高，分別為8.815和8.769倍，愈傷組織生長良好。其次為1/2MS培養(yǎng)基上只添加ZT 0.8 mg/L，其增殖系數(shù)為7.049。在1/8MS培養(yǎng)基上添加KT 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，愈傷組織的增殖系數(shù)最低，為1.572，且愈傷組織長勢較差。

2.4 愈傷組織的分化情況

從表11看出，以成年火龍果植株上的莖段為外植體，誘導愈傷組織后再進行分化比較困難，不定芽的分化率較低。各處理中，愈傷組織最高分化率僅為13.3 %，最低分化率為0。當TDZ濃度為0.4 mg/L，2,4-D濃度為0.5～1.0 mg/L，NAA濃度為0.4～0.6 mg/L時，加入20 %～30 %椰子水對愈傷的分化具有一定促進作用(圖1)。

3 討 論

3.1 防止外植體污染及褐化的研究

火龍果屬攀援性肉莖植株，葉片退化成刺，因此與其他植物相比，消毒方式存在一定差異。本研究以成年植株的火龍果莖段為試材，發(fā)現(xiàn)莖段的成熟度、消毒方式、取樣時間、是否帶刺座及不同品種的火龍果枝條對外植體的褐化、污染及成活情況均有影響，這與前人研究存在相似之處。如周傳明等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用0.1 %的升汞對火龍果莖段進行表面消毒15 min，組培過程中污染率較少，但褐化率較嚴重，這可能由于消毒時間太長導致莖段組織細胞被毒害，出現(xiàn)組織褐變壞死，部分組織甚至變成暗黑色。彭綠春等[10]對是否帶刺座和絨毛的2種外植體類型進行研究表明，同一滅菌消毒方式下，莖段污染率以帶有刺座和絨毛的明顯高于不帶刺座和絨毛的，且污染主要出現(xiàn)在刺座處，這可能由于火龍果刺座一般都木栓化，消毒劑不容易從刺座處滲入，造成滅菌不徹底。不同品種相同處理下，以紫紅龍莖段的污染率最高，晶紅龍和粉紅龍之間無顯著差異，這可能由于后兩者較前者而言，枝條寬大肥厚，且形成木栓化的棱邊對各種菌的浸染有一定保護作用所致。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，以春季萌發(fā)的枝條作外植體，其污染率顯著低于夏、秋、冬季，這可能由于新生枝條本身帶菌較少，而后期生長過程中由于長期暴露在空氣中容易感染各種病菌。

表10 不同基本培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑濃度配比下火龍果愈傷組織的增殖情況

注:“+”、 “++” 和“+++”分別表示愈傷組織生長較差、一般和良好。

Note: +，++ and +++ represent poor growth, common growth and good growth respectively.

表11不同生長調(diào)節(jié)劑濃度及配比和椰子水濃度與火龍果愈傷組織分化

Table 11 Differentiation ofHylocereusundatuscalli cultured on different media with different concentration and ratio of different growth regulators and different concentration of coconut water

TDZ(mg/L)2, 4-D(mg/L)NAA(mg/L)椰子水(%)Coconut water愈傷組織分化率(%)Callus differentiation rate不定芽數(shù)(個)Number of adventitious buds不定芽長勢Growth vigor of adventitious buds0.20.50.1000-0.21.00.2106.72.3++0.21.50.4208.33.5+++0.22.00.6303.31.2+0.40.50.63013.33.7+++0.41.00.42012.42.8+++0.41.50.1108.32.2++0.42.00.205.02.4+0.80.50.61000-0.81.00.401.72.1+0.81.50.23000-0.82.00.1205.01.9++1.20.50.2203.32.5++1.21.00.1306.71.6+++1.21.50.6000-1.22.00.41000-

注:表中“+”為不定芽生長較差，“++”為不定芽生長一般，“+++”為不定芽生長較好。

Note: +，++ and +++ represent poor growth，common growth and good growth, respectively.

圖1 火龍果愈傷組織的分化情況Fig.1 Differentiation of Hylocereus undatus calli

3.2 成熟莖段再生體系建立與優(yōu)化研究

建立完善的再生體系是植物進行育種改良的前提和基礎。而前人對火龍果再生體系建立的研究多以種子作為外植體，并以此萌發(fā)的幼苗、胚或子葉進行愈傷組織誘導、增殖及分化[12, 16-17]。盡管火龍果種子的發(fā)芽率較高，但以此擴繁進行商業(yè)用途是不可行的，這是因為用種子獲得的實生苗有一個較長的童期，不利于火龍果提早結(jié)果。此外，因火龍果種子數(shù)量較大，以此獲得的器官組織可能存在基因型千差萬別，離體培養(yǎng)產(chǎn)生的后代性狀并不能與母本保持一致水平。另外，采用火龍果成熟莖段作外植體的相關報道也較多，但大多數(shù)研究是直接利用莖段進行不定芽誘導和快速增殖[4, 8, 10, 15, 18]，少有利用成熟莖段作外植體進行愈傷組織誘導和分化的相關報道[3, 6]。本研究以貴州主栽品種紫紅龍枝條作外植體，雖已成功建立起再生體系，但總體來講，以火龍果成年植株的莖段作外植體，誘導出愈傷組織后進行再分化比較困難，最高分化率僅為13.3 %，因此下一步針對分化難的問題需要作進一步探討和優(yōu)化。

4 結(jié) 論

利用成年火龍果植株莖段進行愈傷組織誘導、增殖及分化的研究表明，適宜幼嫩莖段表面滅菌的方式為75 %的酒精消毒30 s+0.1 %的HgCl2消毒6～8 min；適宜成熟莖段表面滅菌的方式為75 %的酒精消毒30 s+0.1 %的HgCl2消毒12～15 min。誘導愈傷組織以春季萌發(fā)的長10～20 cm枝條中部莖段效果較好，最適愈傷組織誘導的培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L，暗培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，愈傷組織為黃綠色、致密狀，外表有顆粒狀突起。愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS+TDZ 0.4 mg/L+KT(或ZT) 0.8 mg/L效果較好，增殖系數(shù)在8倍以上。在愈傷組織分化過程中，添加20 %～30 %的椰子水對不定芽的形成具有一定促進作用，但總體分化率仍然較低。