感染H3N2亞型SwIV榮昌仔豬組織臟器的損傷及其載毒分析

朱買勛，張邑帆，付利芝，徐登峰，周 雪

(重慶市畜牧科學院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 榮昌 402460)

【研究意義】豬流感(Swine influenza)是由豬流感病毒(swine influenza virus，SwIV)引起的一種人畜共患病。該病毒在病毒感染、增殖過程中容易引起病毒免疫逃逸，可能引起病毒侵襲宿主的受體結(jié)合位點發(fā)生生物學活性改變，能不同動物種源間傳播，侵害其免疫系統(tǒng)，影響生長發(fā)育，嚴重危害豬、禽、人的健康?！厩叭搜芯窟M展】SwIV屬于正黏病毒科的A型流感病毒，是一種溫和型、高傳染性的呼吸道疾病，臨床上以發(fā)熱、厭食、呼吸困難、咳嗽等臨床癥狀為主，未出現(xiàn)其他的典型癥狀。在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的流感病毒亞型有H1N1、H3N2、H1N2、H9N2、H5N1等，在豬群間廣泛流行的流感病毒有典型豬H1N1、類禽型H1N1和類人型H3N2亞型毒株[1-2]。豬只在短暫感染豬流感病毒后，其先天性免疫系統(tǒng)在受到侵害的同時，還會激發(fā)機體的免疫防御系統(tǒng)，促進組織細胞分泌抗病毒類細胞因子，如干擾素、腫瘤壞死因子、白細胞介素等，參與機體的抗病毒作用，使患病豬在短期內(nèi)快速恢復[3-5]。給仔豬滴鼻感染H3N2病毒，在感染病毒后第5天特異性sIgA的抗體水平會迅速升高，積極的參與機體的免疫應(yīng)答[6]。如果病毒的毒力較強或者病毒的持續(xù)感染，會嚴重損傷豬的免疫系統(tǒng)，抑制感染豬的生長發(fā)育，增強豬對疾病的易感性。在體外用SwIV分離株感染豬肺巨噬細胞，72 h后細胞形態(tài)發(fā)生改變，凋亡細胞達25 %，推測SwIV可以誘導豬肺巨噬細胞凋亡，導致機體免疫抑制[7]。H3N2亞型流感病毒還會出現(xiàn)抗原漂移現(xiàn)象，引起宿主免疫逃逸，形成新的流行[8]。在防治過程中，主要方式是接種疫苗進行免疫，SwIV對烷胺類藥物有明顯的耐藥性[9]。 【本研究的切入點】重慶是西南地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)比較集中地區(qū)，養(yǎng)豬業(yè)占據(jù)了主要部分，每年因疾病造成了巨大的損失。SwIV感染豬群一般不會有典型的臨床征兆，還未來得及進行疾病治療就造成動物的損傷，影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)。但是SwIV在重慶地區(qū)的流行調(diào)查還未受到重視。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了明確H3N2型SwIV對仔豬組織臟器引起的損傷變化，本研究使用H3N2型SwIV人工感染仔豬，分析該病毒對榮昌仔豬組織臟器的損傷及其在組織中的載毒情況，可以使臨床中實施SwIV防治更有針對性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗動物和病毒 試驗仔豬，榮昌豬品系，25日齡，購自重慶市育種豬場；雞胚，SPF級，10日齡，購自濟南斯派瑞福禽業(yè)科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2014 0005；豬流感病毒，H3N2亞型，由重慶市畜牧科學院獸醫(yī)研究所分離鑒定，并做保存[10]。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒，Solarbio公司產(chǎn)品； One step RT-PCR Kit，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，Swine Infuenza (H1N1) Antibody Test Kit、Swine Infuenza (H3N2) Antibody Test Kit，BIOVET公司生產(chǎn)。

1.2 病毒的增殖培養(yǎng)

選用10日齡的SPF雞胚，用鉛筆畫出氣室和胚位，在氣室接近胚體處消毒后，用鋼錐穿一小孔，接種0.2 mL H3N2豬流感病毒液，石蠟封口，并置于孵化箱孵育，保持溫度(37±1) ℃，濕度50 %～60 %，每天檢胚2次，棄除24 h內(nèi)死亡雞胚，24～72 h內(nèi)死亡的胚胎置4 ℃冰箱30 min，收集尿囊液，收獲的尿囊液無菌檢驗后在-80 ℃冰箱中保存。

1.3 病毒的鑒定

參照GenBank，選擇H3N2亞型SwIV毒株的HA基因序列(No.AF251419)設(shè)計引物，上游引物SwIV1：5’-GTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’，下游引物SwIV2：5’-CCTCTAGTTTGTTTCTCTGGTAC-3’，按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，按RT-PCR一步法試劑盒要求，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μl，Buffer 25 μl，上下游引物各1 μl，RNA模板5 μl，加ddH2O補足50 μl，反應(yīng)程序為：50 ℃ 30 min； 94 ℃ 2 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 30個循環(huán)，75 ℃延伸10 min，取5 μl PCR產(chǎn)物進行電泳分析，預期產(chǎn)物1065 bp。

1.4 病毒半數(shù)感染量測定

參照Reed-Muench法[11]，用病毒稀釋液把培養(yǎng)所得尿囊液進行10倍梯度稀釋，從10-1稀釋至10-10，共10個稀釋度，每個稀釋度接種9～11 d 的SPF雞胚5枚，接種量為0.1 mL/枚，37 ℃溫箱培養(yǎng)，逐日觀察至120 h，期間死亡的雞胚及時拿出冷藏4 h或過夜，收獲每枚雞胚的尿囊液，分離。用1 %雞紅細胞懸液做血凝試驗，逐枚檢測雞胚尿囊液中病毒的血凝價，當HA≥1∶128時判為感染，根據(jù)血凝價計算EID50。

1.5 仔豬感染SwIV病毒

在試驗前，前腔靜脈采集仔豬血液2～3 mL，分離血清，采用ELISA檢測仔豬血清豬流感H1N1和H3N2抗體，選擇抗體為陰性仔豬進行感染病毒。選擇6頭H1N1和H3N2抗體均為陰性的仔豬，隨機分為試驗組和對照組，每組3頭，試驗組滴鼻攻毒H3N2 SwIV 5 mL/只，對照組滴鼻5 mL生理鹽水，觀察仔豬臨床癥狀。

1.6 臨床檢查及病理學觀察

豬流感潛伏期為1～3 d，持續(xù)感染6～7 d，試驗選擇在接種病毒后第5天剖殺試驗仔豬，檢查仔豬組織臟器的臨床變化。取病理變化較為嚴重的組織，用10 %甲醛固定，參照文獻操作，進行組織切片的制作[12]。制作好的切片采用顯微成像系統(tǒng)進行拍照記錄組織損傷變化。

1.7 仔豬組織載毒檢測

采集心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等組織，剪成2～3 mm2組織塊，迅速置于液氮中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PT-PCR檢測豬流感病毒在心、肝、脾、肺、腎和淋巴結(jié)中的載毒量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SwIV增殖及鑒定

SwIV接種SPF雞胚后，24 h內(nèi)死亡3枚，檢查發(fā)現(xiàn)胚體質(zhì)軟易碎，全身出血；24～72 h內(nèi)死亡42枚，收集尿囊液約380 mL，-80 ℃保存，胚體弱小，全身出血；對照組雞胚直至72 h未死亡，雞胚正常發(fā)育，已長出絨毛。從收集的雞胚尿囊液中提取病毒RNA，用HA引物進行RT-PCR擴增，在1065 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖1)，與預期結(jié)果相符合，說明收集的病毒液為目的病毒。

表1 H3N2感染雞胚結(jié)果

2.2 SwIV效價測定

病毒液經(jīng)血凝試驗檢測出各個稀釋度病毒液的雞胚感染數(shù)(表1)，Reed-Muench法統(tǒng)計得出病毒液EID50為106.5/mL。

2.3 感染H3N2型SwIV仔豬的臨床和病理學變化

接種病毒后，試驗組仔豬體溫升高，有輕微腹瀉，食欲正常，精神不振。剖解試驗組仔豬發(fā)現(xiàn)肺臟邊緣淤血，表面有損傷壞死(圖2，見封三)；其他組織未見典型病變。取肺組織制作石蠟切片，觀察結(jié)果顯示試驗組仔豬肺泡壁增厚，肺泡內(nèi)有纖維性滲出和炎癥細胞聚集，對照組仔豬肺泡完整，無異常變化(圖3，見封三)。

2.4 感染仔豬的載毒檢測

經(jīng)RT-PCR檢測，在試驗組仔豬肺臟樣品中檢測出H3N2型 SwIV，而心、肝、脾、腎臟和淋巴結(jié)檢測結(jié)果均為陰性(圖4)，說明H3N2型 SwIV主要感染于仔豬的肺臟組織。

3 討 論

豬流感是由A型流感病毒引起的急性呼吸道疾病，在豬群間基本沒有其流行的臨床征兆。SwIV侵入機體時，在呼吸道和消化道黏膜上皮細胞內(nèi)進行增殖，隨著病毒的增殖和損傷，引起動物精神倦怠，咳嗽，食欲不振等輕微的臨床癥狀。這個時候會激起機體的免疫，最終形成自然恢復的現(xiàn)象。如果病毒的持續(xù)感染，導致上皮細胞感染，進一步損傷組織器官，要表現(xiàn)出典型的組織病變和相應(yīng)的癥狀，流感病毒濃度值必須達到一定的量。試驗中仔豬在滴鼻接種H3N2亞型SwIV后，仔豬未出現(xiàn)典型的臨床癥狀，但是肺臟組織已經(jīng)受到嚴重的損傷，肺泡壁增厚，肺泡內(nèi)有纖維性滲出和炎癥細胞聚集。分析原因可能是病毒在肺臟組織中進行擴散，形成感染，造成組織損傷。但是病毒的量還只局限于局部臟器的損傷，流感病毒還沒有通過血流侵入血流中致使機體發(fā)生典型的臨床癥狀。

1：陽性對照；2：病毒液1: Positive control; 2: Viral solution圖1 豬流感HA基因RT-PCR結(jié)果 Fig.1 RT-PCR result of SwIV HA gene

對感染H3N2型 SwIV組織載毒情況分析，在肺臟組織中檢測到病毒，脾臟、肝臟、腎臟、心臟、淋巴結(jié)中均沒有檢測到SwIV，說明H3N2型 SwIV在感染仔豬時病毒主要蓄積在肺臟組織。大量的SwIV聚集在肺臟組織中，由于肺部病毒誘導的細胞因子產(chǎn)量不高，機體表現(xiàn)出輕微感染癥狀，病毒在呼吸道的含量及達到產(chǎn)生感染性病毒的細胞因子的程度，但是機體經(jīng)過免疫刺激后，流感病毒中原有的抗病毒的細胞因子消失[13]。

1：心臟；2：肝臟；3：脾臟；4：肺臟；5：腎臟；6：淋巴結(jié)1: Heart; 2:Liver; 3: Spleen; 4: Lung; 5：Lidneys；6: Lymph nodes圖4 仔豬組織中H3N2豬流感病毒HA基因檢測Fig.4 RT-PCR result of major organs in pigs infected with H3N2 SwIV

結(jié)合H3N2型 SwIV感染仔豬的臨床變化和組織病理學分析，在防治SwI的時候，雖然臨床上還未表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，但可能已經(jīng)造成了組織器官的損傷，且H3N2型 SwIV主要載毒在肺臟組織中，臨床治療過程中應(yīng)當注意組織器官的修復，尤其是肺臟組織。此外，由于傳播方式比較廣，還要注意疫苗進行預防，應(yīng)該加強對SwIV的長期監(jiān)控，做到疾病凈化，防止SwI在人畜間的傳播[14]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示感染H3N2型SwIV仔豬不一定出現(xiàn)典型臨床癥狀，但其組織受到嚴重損傷，且主要載毒于肺臟組織。