馬來西亞鏈霉菌ECO 00002產(chǎn)Azalomycin F發(fā)酵條件優(yōu)化

張 慶，白亭亭，李銘剛，何 翔，徐勝濤，倪 明 ，番華彩，曾 莉，楊佩文*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學(xué)，云南 昆明 650091；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】 楊佩文等針對(duì)馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO 00002活性化合物分離及結(jié)構(gòu)分析顯示，該菌株活性部位主要含兩種結(jié)構(gòu)類似的同系化合物，經(jīng)HPLC制備純化，并通過詳細(xì)的1H和13C NMR數(shù)據(jù)測(cè)定及文獻(xiàn)對(duì)比分析，確定活性化合物為阿扎霉素F3和F4[1]。前期生物活性測(cè)定結(jié)果表明，其對(duì)多種植物病原真菌有較強(qiáng)的抑菌活性[2]。然而前期研究表明，該活性化合物產(chǎn)量較低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，限制了對(duì)它的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】阿扎霉素 F類化合物最早于1959年由Arai從吸水鏈霉菌阿扎霉素變種(S.hygroscopicusvar.azalomyceticus) 中分離得到，主要成分為3 個(gè)36 元多羥基大環(huán)內(nèi)酯化合物阿扎霉素 F5a、F4a和 F3a[3-5]，目前報(bào)道的該類化合物約30個(gè)[6-7]。阿扎霉素 F類化合物具有高效廣譜抗植物病原真菌活性，小鼠(mouse)口服LD50為300～580 mg/kg，大鼠(rat)口服LD50為980 mg/kg，其毒性分級(jí)為低毒III級(jí)，具備開發(fā)為防治作物真菌病害的低毒高效農(nóng)用抗生素的潛力[8]?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】根據(jù)該菌株生長(zhǎng)特性和活性化合物阿扎霉素F合成的條件需求，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，創(chuàng)造適合菌株生長(zhǎng)和目標(biāo)活性化合物合成的最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，是提高菌株發(fā)酵水平和降低生產(chǎn)成本的有效途徑[9-10]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以提高馬來西亞鏈霉菌ECO 00002的阿扎霉素F產(chǎn)量為目標(biāo)，在對(duì)菌株種子培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)考察碳氮源對(duì)目標(biāo)活性化合物生物合成的影響，篩選適宜的碳氮源，優(yōu)化其配比，并進(jìn)一步優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，為菌株發(fā)酵工藝產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

云南大學(xué)微生物研究所保藏菌種馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO-00002。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏4 g，葡萄糖4 g，麥芽膏5 g，復(fù)合維生素(維生素B11 mg，維生素B61 mg，核黃素1 mg，煙酸1 mg，苯丙氨酸1 mg，生物素1 mg，丙氨酸0.3 mg)，微量鹽(FeSO4·7H2O20 mg，MnCl2·2H2O 10 mg，ZnSO4·7H2O10 mg)，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.5，制作平板和試管斜面。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖14.5 g，酵母膏15 g，麥芽膏20 g，CaCO33 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·4H2O 0.1 g，KH2PO40.2 g，水1000 mL，pH 7.5。PB試驗(yàn)和RSM試驗(yàn)培養(yǎng)基：采用STATISTICA 6.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并配制相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基于1×105Pa下滅菌20 min。

1.3 PB和RSA試驗(yàn)方法

采用PB設(shè)計(jì)考察主要的碳氮源成分對(duì)阿扎霉素F產(chǎn)量的影響，篩選適宜的碳氮源；在此基礎(chǔ)上，采用RSA法優(yōu)化適宜碳氮源的比例。具體方法：將供試菌株接種于斜面試管培養(yǎng)基上，然后置于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)120 h。再用滅菌蒸餾水洗下菌體，并按照10 % 的接種量接入裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，28 ℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)至48 h。再取種子液10 mL接種于裝有100 mL發(fā)酵液(PB培養(yǎng)基和RSA培養(yǎng)基)的500 mL三角瓶中，于28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定阿扎霉素F的含量。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)方法

在培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行溫度、起始pH、發(fā)酵瓶裝液量、接種量、發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件對(duì)阿扎霉素F產(chǎn)量的影響試驗(yàn)。溫度設(shè)置24 ℃，28 ℃，32 ℃，36 ℃等4個(gè)梯度；pH值設(shè)置6.0，6.5，7.0，7.5，8.0等5梯度；裝液量設(shè)置50 mL/500 mL，75 mL/500 mL，100 mL/500 mL，125 mL/500 mL等4梯度；接種量設(shè)置2 %，4 %，6 %，8 %，10 %等5個(gè)梯度；發(fā)酵時(shí)間設(shè)置8，16，32，40，48，64，72，80，88，96，104 h等11個(gè)梯度。測(cè)定各試驗(yàn)阿扎霉素F的含量。

1.5 發(fā)酵罐放大發(fā)酵試驗(yàn)方法

利用50 L自動(dòng)生物發(fā)酵罐驗(yàn)證菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的發(fā)酵條件。將發(fā)酵罐內(nèi)外全面清洗干凈，檢查發(fā)酵罐的密閉性。用標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖液對(duì)罐體上的pH監(jiān)測(cè)探頭進(jìn)行校準(zhǔn)。裝入配制好的優(yōu)化培養(yǎng)基25 L，關(guān)閉發(fā)酵罐頂蓋。通過發(fā)酵罐控制面板設(shè)定滅菌程序滅菌30 min。待溫度冷卻后，通過火焰圈接種法按10 %接種量接種。設(shè)定發(fā)酵參數(shù)：攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度28 ℃，通氣量60 L/min，進(jìn)氣壓力1.0 bar、罐內(nèi)壓0.3 bar。從24 h后開始定時(shí)取樣，取樣量為50 mL，測(cè)定菌體體積和阿扎霉素F的含量。

1.6 分析方法

菌體體積測(cè)定：將所取發(fā)酵液10 mL裝到帶刻度的試管中，靜置12 h后測(cè)量菌絲沉降體積。阿扎霉素F含量測(cè)定：取發(fā)酵液50 mL，進(jìn)樣于經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂層析柱，然后分別用甲醇∶水體積比為6∶4、7∶3、10∶0的洗脫液梯度洗脫，HPLC測(cè)定10∶0洗脫部分阿扎霉素F含量。HPLC系統(tǒng)采用Waters 515二元高壓泵，2966PDA檢測(cè)器，Hanban C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為甲醇∶水(8∶2)，檢測(cè)波長(zhǎng)241.0 nm，進(jìn)樣量20 μl，流速1.0 mL/min，分析時(shí)間20 min。含量根據(jù)色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積對(duì)比進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗(yàn)結(jié)果與分析

采用STATISTICA 6.0軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)組成中的葡萄糖、淀粉、酵母膏、大豆粉、NaCl、K2HPO4等6個(gè)因素進(jìn)行篩選，每個(gè)因素設(shè)高低2個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1～2所示。

由回歸分析可知，大豆粉和葡萄糖是主要的影響因素，二者在大于95 %的概率水平上差異顯著。淀粉、酵母膏、NaCl、K2HPO4等4個(gè)因素在95 %的概率水平上差異不顯著，由此確定大豆粉和葡萄糖為主要因素進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 RSA試驗(yàn)結(jié)果與分析

在PB實(shí)驗(yàn)回歸分析基礎(chǔ)上，采用STATISTICA 6.0軟件進(jìn)行RSA試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄糖和大豆粉的配比進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3～4和圖1所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明：各因素之間有一定交互作用，二次方模型與上述結(jié)果的擬合較好(模型的R2>0.98)。各因素優(yōu)化的比例為葡萄糖1.59 %，大豆粉2.90 %。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源篩選PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源篩選試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表3 碳氮源濃度響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及阿扎霉素產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果

表4 碳氮源濃度響應(yīng)面試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

圖1 響應(yīng)面分析法確定響應(yīng)最大值Fig.1 The maximum response value determined by RSA test

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明(表5)：發(fā)酵溫度在24～36 ℃，隨著溫度提高阿扎霉素F HPLC效價(jià)先提高后下降，28 ℃時(shí)效價(jià)為最高。發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH在6.0～8.0，隨著pH升高阿扎霉素F HPLC效價(jià)先提高后下降，7.5時(shí)效價(jià)為最高。在500 mL三角瓶裝液量為50 mL時(shí)阿扎霉素F HPLC效價(jià)最高，隨著裝液量的增加效價(jià)逐漸下降；接種量分別以2 %、4 %、6 %、8 %、10 %接種，隨著接種量的增加阿扎霉素F HPLC效價(jià)逐漸提高。綜合考慮裝液量、通氣量和生產(chǎn)成本，適宜裝液量為100 mL/500 mL，接種量為10 %。阿扎霉素F在0～16 h時(shí)間段沒有合成，而在24～72 h時(shí)間段內(nèi)大量合成，并在72 h時(shí)HPLC效價(jià)達(dá)到最高值，之后逐漸下降，因此，確定菌株的發(fā)酵終點(diǎn)定為72 h。

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

將一級(jí)種子接種到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，于優(yōu)化的培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)。不同時(shí)間取樣，測(cè)定阿扎霉素F HPLC效價(jià)、菌絲生物量及pH，試驗(yàn)結(jié)果表6所示。48 h前，菌體處于指數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵液pH一直下降；48 h后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，阿扎霉素F合成速度加快，在72 h HPLC效價(jià)達(dá)最高，為1950.26 μg/mL。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，阿扎霉素F HPLC效價(jià)呈下降趨勢(shì)，88 h發(fā)酵液pH值急劇上升，顯微鏡檢察發(fā)現(xiàn)菌體自溶。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，阿扎霉素F HPLC效價(jià)由原來的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效價(jià)提高約205.88 %(P<0.01)。

2.4 發(fā)酵罐放大發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與分析

50 L自動(dòng)生物發(fā)酵罐驗(yàn)證優(yōu)化條件試驗(yàn)過程中，各階段阿扎霉素F含量和菌絲體沉降體積變化情況如表7所示。從上罐至18 h，菌體開始生長(zhǎng)，整個(gè)過程中菌絲體積的變化呈現(xiàn)平緩增加的趨勢(shì)，阿扎霉素F從24 h時(shí)開始產(chǎn)生，到63 h時(shí)達(dá)到最高效價(jià)，為2094.12 μg /mL。

表7 發(fā)酵過程中阿扎霉素F和菌絲沉降體積結(jié)果

3 討 論

3.1 阿扎霉素 F類化合物農(nóng)抗應(yīng)用前景及存在問題

阿扎霉素F是一類含氧雜環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道從S.hygroscopicusvar.azalornyceticus、S.hygroscopicusA1491、S.violaceusnigerRS-22、S.hygroscopicusMSU/IVIIV-4-75B、Actinomycetesp. HILY-9120362、S.malaysiensisECO-00002、S.malaysiensisMJM1968J 及S. sp. 211726等多種鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中先后發(fā)現(xiàn)了該類化合物，具有顯著的抗真菌、革蘭氏陽性菌和抗腫瘤活性，具備開發(fā)為高效農(nóng)用抗生素的潛力，但由于缺乏系統(tǒng)成藥基礎(chǔ)研究，導(dǎo)致下游開發(fā)形成瓶頸，截止目前尚未作為農(nóng)用抗生素在國(guó)內(nèi)登記使用[11-17]。馬來西亞鏈霉菌ECO 00002分離自云南省寧蒗縣土壤樣品產(chǎn)阿扎霉素新的野生型菌株，產(chǎn)率相對(duì)較低，通過選育優(yōu)良菌株或利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株，結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵工程和代謝工程技術(shù)，優(yōu)化菌株定向發(fā)酵調(diào)控工藝，提高活性化合物阿扎霉素F的生產(chǎn)率，是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的主要途徑。本研究結(jié)果表明，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，可以顯著提高目標(biāo)活性化合物阿扎霉素F的產(chǎn)率，而選育優(yōu)良菌株或利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株是下一步需要重點(diǎn)開展的研究?jī)?nèi)容。

3.2 阿扎霉素 F類化合物代謝調(diào)控的闡明對(duì)于菌株選育、遺傳改良和發(fā)酵優(yōu)化的指導(dǎo)作用

闡明阿扎霉素F類化合物的形成遺傳機(jī)制和生物合成過程是菌株選育和遺傳改良的基礎(chǔ)，也是菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的前提。阿扎霉素F類化合物的生物合成是在復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控作用下完成，調(diào)控因子通過不同的機(jī)制發(fā)揮其全局調(diào)控的作用[18]。因此，通過調(diào)節(jié)正調(diào)控因子可以提高化合物的產(chǎn)率，抑制負(fù)調(diào)控因子可以解除對(duì)化合物合成的抑制作用而實(shí)現(xiàn)提高產(chǎn)率的目的。阿扎霉素F系含氧雜環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其生物合成是由包括?；o酶A活化羧酸等一系列多次重復(fù)的醇醛縮合反應(yīng)，催化形成具有一定長(zhǎng)度的聚酮鏈骨架，然后該聚酮鏈骨架經(jīng)過環(huán)化，或者與脫氧糖等結(jié)構(gòu)單元連接而形成[5]。阿扎霉素B的生物合成機(jī)制是最先被闡明的阿扎霉素類化合物，該化合物具有一個(gè)非常稀有的C-2對(duì)稱結(jié)構(gòu)，屬于16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其碳骨架主要來源于6個(gè)丙酸鹽、8個(gè)乙酸鹽和2個(gè)丁酸鹽，利用頭尾縮合式的聚酮類化合物的合成方式合成，其中包括來源于葡萄糖的2-脫氧巖藻糖，來源于丙酸鹽的3個(gè)甲基基團(tuán)，結(jié)構(gòu)中糖苷配基中的氧原子來源于聚酮生物合成過程中的前體物質(zhì)[19]。而阿扎霉素F系列化合物的研究主要集中在活性測(cè)試和結(jié)構(gòu)鑒定等方面，生物合成機(jī)制尚未完全明確[20]，化合物代謝調(diào)控的闡明對(duì)于菌株選育、遺傳改良和發(fā)酵優(yōu)化的將具有重要的指導(dǎo)作用。

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)于阿扎霉素 F類化合物生物合成的影響

無機(jī)鹽、微量元素、生長(zhǎng)因子、前體和抑制劑等培養(yǎng)基組成也是菌體生長(zhǎng)繁殖和目標(biāo)活性化合物的生物合成的重要影響因素。從阿扎素F類化合物生物合成途徑及與其相關(guān)的代謝途徑出發(fā)，篩選促進(jìn)化合物生物合成的影響因素是提高產(chǎn)率的另一重要途徑。

4 結(jié) 論

馬來西亞鏈霉菌ECO 00002發(fā)酵培養(yǎng)基中主要的影響因素為大豆粉和葡萄糖，其最大響應(yīng)值分別為2.90 %和1.59 %；優(yōu)化的發(fā)酵條件為初始pH 7.5，裝液量100 mL/500 mL，接種量為10 %，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，搖瓶水平上阿扎霉素F HPLC效價(jià)由原來的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效價(jià)提高率為205.88 %(P<0.01)；100 L發(fā)酵罐阿扎霉素F的HPLC效價(jià)為2094.12 μg /mL，阿扎霉素F類化合物的HPLC效價(jià)大幅度提高。