腎素-血管緊張素系統(tǒng)在慢性束縛應激誘導的小鼠白細胞介素表達中的作用

康登峰 肖體先 吳天翼等

[摘要] 目的 探討腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在慢性束縛應激誘導下對小鼠白細胞介素表達的作用。 方法 以慢性束縛應激法建立應激模型，對其中部分小鼠注射血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）以阻斷RAS。本實驗將50只雄性C57小鼠隨機平均分為5組：對照組（Ctrl）、束縛一周組（R1w）、束縛一周+ACEI組 （R1w+ACEI）、束縛二周組（R2w）、束縛二周+ACEI組（R2w+ACEI），其中R1w+ACEI和R2w+ACEI兩組束縛前30 min腹腔注射卡托普利，最后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12的濃度。 結(jié)果 與Ctrl組相比，R1w組IL-2、IL-4、IL-6、IL-12濃度明顯升高（P<0.05），R2w組 IL-2、IL-4、IL-6濃度明顯升高（P<0.05）;卡托普利處理一周及二周以后IL-12的濃度顯著下降（P<0.05）。 結(jié)論 慢性束縛應激初期可引起免疫因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-12水平增高，機體處于高免疫活性狀態(tài)。RAS參與了慢性束縛應激誘導的IL-12的激活，與IL-2、IL-4、IL-6無關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）;應激;白介素;免疫

[中圖分類號] R392? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）04-0031-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of renin-angiotensin system（RAS）on the expression of interleukin in mice induced by chronic restraint stress. Methods A stress model was established by chronic restraint stress method. Some mice were injected with angiotensin -converting enzyme inhibitor（ACEI） to block RAS. In this experiment， 50 male C57 mice were randomly divided into 5 groups： control group（Ctrl）， restraint one-week group（R1w）， restraint one week+ACEI group（R1w+ACEI）， restraint two-week group （R2w）， and restraint two-week +ACEI group（R2w+ACEI）， in which R1w+ACEI and R2w+ACEI were intraperitoneally injected with captopril 30 min before the restraint. And finally serum concentration of IL-2， of IL-4， IL-6 and IL-12 was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results Compared with that of the Ctrl group， the concentration of IL-2， IL-4， IL-6 and IL-12 in the R1w group was significantly increased（P<0.05）， and the concentration of IL-2， IL-4 and IL-6 in the R2w group was significantly increased（P<0.05）. IL-12 concentrations were significantly decreased after one week and two weeks of captopril treatment（P<0.05）. Conclusion The early stage of chronic restraint stress can cause the levels of immune factors IL-2， IL-4， IL-6 and IL-12 to increase， and the body is in a state of high immunological activity. RAS is involved in the activation of IL-12 induced by chronic restraint stress， independent of IL-2， IL-4， and IL-6.

[Key words] Renin-angiotensin system（RAS）;Stress;Interleukin;Immunity

隨著社會發(fā)展，競爭日益激烈，帶給人們的壓力與挑戰(zhàn)使人們處于慢性應激狀態(tài)下。目前有研究證實，長期及反復的慢性應激能夠?qū)游锖腿祟惖拿庖吖δ墚a(chǎn)生抑制[1]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)是重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對水電解質(zhì)與血壓調(diào)節(jié)具有重要作用。有研究表明，循環(huán)及組織內(nèi)RAS也是一個應激激素反應系統(tǒng)，與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis，HPA）和交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)（Sympathetic-adrenal medulla system，SAMS）之間存在著密切聯(lián)系[2]，應激時RAS成分表達增加[3]，說明RAS參與了應激反應。腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號級聯(lián)的多個組分均會影響炎性細胞表型和功能，均會影響機體的免疫功能[4]，其中血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ）可能導致腎小球腎炎中的蛋白尿和腎組織損傷，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可以減少這一損傷[5]，另外，有研究表明Ang Ⅱ可直接促進T細胞增生[6]。如前所述，RAS系統(tǒng)對免疫功能的影響，在過去的研究中，已有多個方向且較完整的認識，本研究則以此為基礎(chǔ)，引入慢性應激因素，繼續(xù)探討其影響。這一方面的研究仍然較少。本研究利用慢性束縛應激雄性C57小鼠，通過卡托普利阻斷RAS，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定小鼠血清中白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-6、IL-12水平的變化，比較阻斷與不阻斷RAS對各白介素水平的影響，來探究以下2個問題：（1）慢性束縛應激引起白介素的變化;（2）RAS是否在這個變化中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

2018年6月1日于蘇州大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院生理學系實驗室開始實驗。健康雄性C57小鼠50只，由蘇州大學實驗動物中心提供。小鼠體重中位數(shù)25 g（20～28 g）。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，濕度（55±5）%。6月1日將動物隨機分為五組：①對照組（Ctrl）10只：不進行應激處理，正常飼養(yǎng);②束縛1周組（R1w）10只，束縛應激6 h/d，持續(xù)1周;③束縛1周+卡托普利組（R1w+ACEI）10只，束縛應激6 h/d，持續(xù)1周，腹腔注射卡托普利;④束縛2周組（R2w）10只，束縛應激6 h/d，持續(xù)2周;⑤束縛2周+卡托普利組（R2w+ACEI）10只，束縛應激6 h/d，持續(xù)2周，腹腔注射卡托普利。自然光照循環(huán)條件下適應環(huán)境7 d后（6月8日）開始制作動物模型，每3天更換一次籠舍和墊料。實驗中除應激期間外均自由飲水及攝食。R1w 組和R1w+ACEI組于6月14日完成模型制作并取血，6月21日完成R2w 組和R2w+ACEI組模型制作并取血。Ctrl組于6月21日取血。

1.2 慢性束縛應激和腹腔注射卡托普利

使用50 mL離心管制作束縛應激裝置，將管壁不同部位鉆出直徑3 mm的小孔，以防止小鼠窒息[7]。將小鼠頭朝向管底放入離心管后封閉管口，以達束縛效果，每天6 h（12：00～18：00），束縛期間禁食禁水，6 h后將小鼠恢復自由?？ㄍ衅绽且环N血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，將卡托普利粉劑[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，產(chǎn)品編碼：C1580]溶于生理鹽水中制得濃度為2.5 mg/mL的卡托普利溶液。R1w+ACEI和R2w+ACEI兩組小鼠，按小鼠體重30 mg/kg進行腹腔注射，注射時間為束縛應激前30 min。本實驗方案經(jīng)蘇州大學實驗動物護理和使用委員會批準后使用。

1.3 標本采集和指標測定

小鼠以4%水合氯醛0.2 mL/只腹腔注射麻醉后摘眼球取血。血樣靜置2 h后常溫4000 r/min離心10 min取上層血清，-80℃保存。血清樣本使用小鼠IL-2、IL-4、IL-6、IL-12/p70 ELISA試劑盒（達科為生物技術(shù)有限公司）于6月22～25日測定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12的濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 束縛應激對IL-2、IL-4、IL-6、IL-12濃度的影響

2.2 ACEI治療1周后對白介素表達的影響

束縛應激同時，采用ACEI治療1周后，IL-2（5.79±0.59）pg/mL、IL-4（40.90±8.98）pg/mL、IL-6（35.31±3.50）pg/mL變化無統(tǒng)計學差異（t=0.141、0.209、0.348，P>0.05），IL-12（27.34±3.63）pg/mL濃度明顯下降（t=0.009，P<0.05）。見圖2。

2.3 ACEI治療2周后對白介素表達的影響

束縛應激同時，采用ACEI治療2周后，IL-2（4.11±1.09）pg/mL、IL-4（37.70±7.44）pg/mL、IL-6（27.44±2.58）pg/mL變化無統(tǒng)計學差異（t=0.155、0.269、0.323，P>0.05），IL-12（11.07±3.86）pg/mL濃度明顯下降（t=0.014，P<0.05）。見圖3。

3 討論

本研究利用慢性束縛法建立動物模型，對軀體不造成物理傷害刺激，很好地模擬了人類慢性抑郁焦慮狀態(tài)[8]。既往研究已證實，慢性應激抑郁癥患者血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、干擾素-c、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等促炎細胞因子水平升高[9]。應激可以引起機體中樞及外周免疫系統(tǒng)的激活，特別是細胞因子的大量分泌[10]。

在免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)之間，某些信息交流是通過特定的細胞因子產(chǎn)生作用的，這些細胞因子可以促使大腦產(chǎn)生化學物質(zhì)及內(nèi)分泌激素，引起神經(jīng)和免疫的改變，在維持穩(wěn)態(tài)及造成某些病理改變中，起重要的調(diào)節(jié)作用[11]。IL-2、IL-4、IL-6、IL-12均為重要的機體免疫相關(guān)細胞因子。其中IL-2通過其對CD4+ T調(diào)節(jié)（Treg）細胞和細胞毒性效應淋巴細胞的作用，參與調(diào)節(jié)免疫耐受和活化[12]。IL-4在調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生，造血和炎癥以及效應T細胞應答的發(fā)展中具有重要作用[13]。IL-6具有環(huán)境依賴性的促進和抗炎特性，目前被認為是臨床干預的重要靶點[14]。IL-12是一種重要的促炎性細胞因子，已被證明在體外和體內(nèi)具有強大的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗感染活性[15]。

血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利（captopril）是常用的ACEI類藥物，通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）的活性，減少Ang Ⅱ的生成，阻斷RAS的作用而產(chǎn)生生物效應。Wohleb ES等[16]研究發(fā)現(xiàn)卡托普利能顯著抑制LPS誘導的DC的IL-12的產(chǎn)生，另外有研究顯示，卡托普利可以使慢性心力衰竭大鼠心肌中TNF-α、IL-6水平[17]及IL-1β、NF-κB水平[18]下降?？梢姡ㄍ衅绽欢ǔ潭壬暇哂薪档脱装Y細胞因子的能力。

本研究顯示，R1w組較Ctrl組，所測各白介素濃度均明顯增高，R2w組IL-2、IL-4、IL-6濃度明顯增高，而IL-12濃度有升高趨勢但并不顯著，但可認為其維持在較高水平，說明束縛應激激活炎癥通路，使得白介素濃度升高。顯然，當小鼠處于應激狀態(tài)時，機體免疫相關(guān)白介素也處于激活狀態(tài)，這很有可能進一步促使機體免疫細胞激活。但我們也觀察到，束縛4周時，四組白介素均略有下降趨勢。有研究顯示，在四周以上的慢性束縛應激中，IL-2在脾中含量相較于正常情況明顯下降，因此，進一步延長實驗時間或許有助于得出更加精確的結(jié)論[19]。

由實驗數(shù)據(jù)可以看出，卡托普利治療1周及2周以后，IL-12濃度顯著下降，IL-2、IL-4、IL-6濃度未出現(xiàn)明顯變化，故RAS在慢性應激情況下不影響IL-2、IL-4、IL-6的表達，但其對IL-12的水平有重要影響。有研究表明，Ang Ⅱ通過降解IKBα（NF-kappa-B inhibitor alpha）及IKBβ（NF-kappa-B inhibitor beta）來激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB），使NF-κB進入胞漿，進而與細胞核內(nèi)炎癥反應調(diào)節(jié)蛋白基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控各種炎癥基因轉(zhuǎn)錄，形成各種炎癥因子[20]。本研究中使用了卡托普利后，IL-12濃度顯著下降，可能原因是卡托普利減少了Ang Ⅱ的產(chǎn)生，從而減少了IL-12的生成。Ravichandran K等[21]的研究結(jié)果顯示，血管緊張素原（Angiotensinogen，AGT）反義寡核苷酸（AGT antisense oligonucleotide，ASO）會抑制AGT mRNA，使AGT減少，進而會導致機體IL-12濃度的下降。在本實驗中，RAS被卡托普利阻斷，則機體內(nèi)AGT的產(chǎn)生會減少，IL-12缺少了促進其產(chǎn)生的刺激因素，從而濃度下降。如前文所述，IL-12可有效抑制腫瘤的發(fā)展，相關(guān)免疫療法已在研究中[22]。也有研究顯示，高濃度的IL-12會導致多種免疫性疾病，例如Ⅰ型糖尿病[23]、類風濕性關(guān)節(jié)炎[24]，銀屑病[25]等。提示在長期慢性應激的情況下，阻斷RAS會使得機體患癌風險提高，但對于已患有某些免疫性疾病的患者，RAS的阻斷可能對治療原發(fā)病有所幫助。

綜上所述，本研究通過對小鼠的慢性束縛應激發(fā)現(xiàn)免疫因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-12水平增高，提示當機體處于長期應激狀態(tài)初期，機體免疫系統(tǒng)被激活，處于活躍狀態(tài)。同時發(fā)現(xiàn)RAS參與了慢性束縛應激誘導的IL-12的激活，與IL-2、IL-4、IL-6無關(guān)。由于本研究尚處于起始階段，所研究白介素種類較少，研究時間較短，但依舊可以為研究腎素-血管緊張素系統(tǒng)與機體免疫功能的關(guān)系提供參考，為進一步得出該系統(tǒng)對機體免疫功能的影響提供思路。

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（收稿日期：2018-10-11）