轉(zhuǎn)BpTCP7白樺耐鹽堿能力分析

張 園，李芳蕊，李 洋，許思佳，安琳君，李慧玉

(東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

我國(guó)鹽漬化和次生鹽漬化土地有4000萬hm2以上，占現(xiàn)有耕地的四分之一，而且鹽漬化日趨嚴(yán)重，影響到我國(guó)農(nóng)林業(yè)的生產(chǎn)。目前，鹽堿地綜合治理主要依靠生物措施，發(fā)掘更多的耐鹽植物是當(dāng)前解決鹽漬化的重要手段。植物耐鹽機(jī)制研究的深入及基因工程育種的發(fā)展，為培育耐鹽植物特別是林木品種提供了新途徑。

TCP是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。TCP基因家族具60個(gè)氨基酸殘基組成的堿性區(qū)-螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)的TCP保守結(jié)構(gòu)域(TCP domain)[1]。根據(jù)其TCP結(jié)構(gòu)域不同分為2個(gè)亞家族，ClassⅠ(TCP-P)和ClassⅡ(TCP-C)，BpTCP7屬于ClassⅡ亞類[2]。研究表明，TCP在植物中參與多種植物激素的應(yīng)答反應(yīng)，通過偶聯(lián)這些激素響應(yīng)過程來調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，如分枝、株高、葉形、花形、種子萌發(fā)、維管束生長(zhǎng)、配子體發(fā)育、光形態(tài)建成以及晝夜節(jié)律調(diào)控。另外，在植物低溫、高鹽等逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用[3-10]。

白樺(Betulaplatyphylla)是我國(guó)東北地區(qū)蓄積量最大的鄉(xiāng)土速生闊葉樹種，也是天然次生林更替的先鋒樹種。前期，通過基因工程育種手段獲得了轉(zhuǎn)BpTCP7基因過表達(dá)白樺植株，本研究以轉(zhuǎn)TCP7白樺為材料，檢測(cè)NaHCO3脅迫后的各轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)量、保護(hù)酶類、滲透調(diào)劑物及MDA含量等指標(biāo)，分析其耐鹽堿能力，并篩選抗鹽堿優(yōu)良的株系，為利用植物改良鹽堿地提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2年生轉(zhuǎn)BpTCP7基因過表達(dá)白樺株系4個(gè)(分別為TCP7-1，TCP7-2，TCP7-3，TCP7-4)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?WT)。通過組培擴(kuò)繁，每個(gè)株系擴(kuò)繁50株。選擇規(guī)格相同的塑料花盆，裝入等量培養(yǎng)土，將苗木移入盆中，第2年夏，在植物生長(zhǎng)旺盛時(shí)，株系內(nèi)選擇生長(zhǎng)基本一致的植株用于NaHCO3脅迫處理試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 處理方法 分別選取每個(gè)株系各36株，分成3組，每組各12株，每盆1株，分別向盆內(nèi)澆入1、2、4 g·L-13種不同質(zhì)量濃度的NaHCO3溶液，以澆入等量清水為對(duì)照。每天澆施500 mL·株-1溶液，處理時(shí)間為12 d。分別在處理0、3、6、9、12 d時(shí)，取植株第3～5片功能葉，每個(gè)株系每個(gè)處理各采樣20片左右，在液氮條件下充分混合研磨成粉末，進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。脅迫處理12 d后，對(duì)試驗(yàn)苗木復(fù)水。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用NBT比色法[11]，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸浸提-酸性茚三酮顯色法[12]，丙二醛(MDA)含量采用TBA 比色法[13]。

生長(zhǎng)量的測(cè)定：鹽處理前和復(fù)水20 d分別用塔尺測(cè)定主干高度，計(jì)算高生長(zhǎng)量和相對(duì)生長(zhǎng)量。高生長(zhǎng)量= 處理結(jié)束后樹高-處理前樹高；相對(duì)生長(zhǎng)量=(處理高生長(zhǎng)量/對(duì)照生長(zhǎng)量)×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖由Excel和SPSS 16.0軟件系統(tǒng)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3脅迫對(duì)細(xì)胞保護(hù)酶活性的影響

SOD是氧自由基代謝的關(guān)鍵酶類，可以清除植物體內(nèi)的自由基，在逆境條件下其活性高低可反映機(jī)體的抗逆能力[14]。從圖1A可以看出，在0.2%NaHCO3脅迫3 d后，轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的SOD活性變化不明顯；6～9 d時(shí)，除了TCP7-4外，其他各株系SOD活性逐漸上升；9 d時(shí)各株系的SOD活性最高，尤其以TCP7-1最為顯著；隨著脅迫時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，各株系SOD活性下降?？傮w上看，在整個(gè)脅迫過程中，轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的SOD活性差異不顯著。在0.4% NaHCO3處理過程中，3 d開始SOD活性提高，但轉(zhuǎn)基因與對(duì)照株系差異不顯著；6 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性顯著高于對(duì)照株系；9 d開始，各株系的SOD活性下降，除TCP7-3外，其他各轉(zhuǎn)基因株系的SOD高于對(duì)照株系(圖1B)。0.8%NaHCO3脅迫過程中，3 d時(shí)，各株系的SOD活性達(dá)到了頂峰，TCP7-1、TCP7-2的SOD活性顯著高于對(duì)照株系；隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，各株系的SOD活性明顯下降，但大部分時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性均高于對(duì)照株系(圖1C)。

圖1 NaHCO3脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的SOD活性的影響

2.2 NaHCO3脅迫對(duì)脂膜的影響

MDA為脂膜過氧化的終端產(chǎn)物，其含量多少可以反映生物膜的危害程度，即MDA的含量越高，生物膜損害越嚴(yán)重[15]。從圖2A可以看出，低濃度NaHCO3脅迫6 d前，轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的MDA含量變化均不明顯；脅迫9～12 d時(shí)，各株系MDA活性表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)；在這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量均低于對(duì)照株系，尤其是TCP7-2株系。在中濃度的NaHCO3處理過程中，6 d時(shí)各株系MDA的活性提高，但轉(zhuǎn)基因與對(duì)照株系差異不顯著；脅迫處理9 d時(shí)，大部分轉(zhuǎn)基因株系的MDA活性顯著高于對(duì)照株系(圖2B)。高濃度NaHCO3脅迫過程中，各株系的MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，各株系的MDA含量均低于對(duì)照株系，尤其是TCP7-4株系(圖3C)。

圖2 NaHCO3脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的MDA含量的影響

2.3 NaHCO3脅迫對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3A可以看出，在0.2%NaHCO3脅迫3 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的脯氨酸含量提高，但各株系間差異不顯著；脅迫6 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系TCP7-3、TCP7-4顯著高于對(duì)照株系；脅迫9 d時(shí)，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量下降，與其他各株系間無顯著差異。在0.4%NaHCO3脅迫3 d時(shí)，各株系的脯氨酸含量急劇上升，轉(zhuǎn)基因株系的含量高于對(duì)照株系；6 d時(shí)，除TCP7-3外，其他各轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量均高于對(duì)照株系，并達(dá)到最高峰；隨著脅迫時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，脯氨酸含量降低。0.8%NaHCO3脅迫后，3 d及6 d時(shí)各株系的脯氨酸含量均上升，除TCP7-1外，其他轉(zhuǎn)基因株系的上升幅度明顯高于對(duì)照株系。

圖3 NaHCO3脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的脯氨酸含量的影響

株系高生長(zhǎng)/cm0.2% NaHCO30.4% NaHCO30.8% NaHCO3相對(duì)生長(zhǎng)量/%0.2% NaHCO30.4% NaHCO30.8% NaHCO3WT13.25±1.25b20.00±1.89b10.80±0.92b---TCP7-18.58±1.33a13.25±1.32a12.67±1.28b6566117TCP7-29.42±1.83a18.17±2.03b18.00±1.24c7191167TCP7-37.58±0.95a17.00±1.75b8.00±0.86a578574TCP7-412.58±1.56b25.50±1.59c26.33±1.98d95128244

2.4 NaHCO3脅迫對(duì)植株高生長(zhǎng)的影響

從表1可以看出，0.2%、0.4%的NaHCO3處理后，只有TCP7-4株系的高生長(zhǎng)高于對(duì)照株系，其他3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均低于對(duì)照株系；但0.8%的NaHCO3處理后，除TCP7-3株系外，其他各株系的樹高生長(zhǎng)量均高于對(duì)照株系，最高的是TCP7-4，相對(duì)生長(zhǎng)量達(dá)到244%，TCP7-2次之，相對(duì)生長(zhǎng)量是167%。

3 結(jié)論與討論

目前針對(duì)TCP的研究集中于發(fā)育調(diào)控，在抗逆方面的研究鮮見報(bào)道。OsTCP19在調(diào)節(jié)非生物脅迫中發(fā)揮了重要的作用，鹽和干旱條件下水稻中OsTCP19基因的表達(dá)量上調(diào)了5～6倍，并且在擬南芥中過量表達(dá)的OsTCP19引起ABI3、ABI4、IAA3的上調(diào)表達(dá)和LOX2下調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致植株的發(fā)育異常[16]。在水曲柳中，研究FmTCP4對(duì)冷、鹽及旱的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mTCP4明顯響應(yīng)了這3種非生物脅迫，并且其響應(yīng)模式并不相同。NaCl處理后，F(xiàn)mTCP4基因的表達(dá)呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)，在6 h出現(xiàn)顯著上調(diào)，達(dá)到峰值，為對(duì)照的70.69倍[17]。在水稻中證明了過量表達(dá)或抑制OsTCP14(PCF6)和OsTCP21顯著降低或增加植物的冷脆弱性，且OsTCP14(PCF6)和OsTCP21在冷脅迫下負(fù)調(diào)控ROS介導(dǎo)的逆境脅迫反應(yīng)[18]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，白樺TCP7啟動(dòng)子中含有鹽、旱及ABA響應(yīng)元件，通過NaCl及PEG處理后TCP7啟動(dòng)子表現(xiàn)出一定的響應(yīng)。本研究對(duì)轉(zhuǎn)TCP7白樺進(jìn)行不同濃度的NaHCO3脅迫處理，發(fā)現(xiàn)低濃度的NaHCO3處理后轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系差別不明顯，但中、高濃度的NaHCO3處理后，對(duì)照株系的細(xì)胞膜損傷程度明顯高于轉(zhuǎn)基因株系，而滲透調(diào)節(jié)物及活性氧清除酶類的積累明顯低于轉(zhuǎn)基因株系，說明BpTCP7基因提高了白樺的抗鹽堿能力。

綜上所述，轉(zhuǎn)TCP7白樺株系在NaHCO3脅迫下，能有效誘導(dǎo)體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)，清除體內(nèi)的活性氧，降低膜脂氧化損傷，一定程度上維持了植物正常的生理代謝活動(dòng)。同時(shí)，通過體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，起到了滲透調(diào)節(jié)的作用，使得轉(zhuǎn)TCP7白樺對(duì)NaHCO3等逆境適應(yīng)性增強(qiáng)。